小鼠肠蛋白，dapdh，想问下背景深和蛋白形状为啥不规则？

我的情况类似，自检多法，借相似蛋白跑跑还有注意下封闭的问题。供参考

感觉是你蛋白量不够，所以条带出的不好，背景深了，要不你换个内参？

有杂带、背景深，这个可能是抗体的问题，一方面是抗体浓度，gapdh抗体浓度一般可以按说明书上的最低浓度使用，另一方面抗体使用次数多或者稀释液不好。重新配一支吧。蛋白形状一般就跟page胶有关，配胶的时候混匀充分一点，玻璃板洗干净一点，如果有漏胶漏得比较多的话建议重配。

背景深和形状不规则可能的原因：膜封闭不够；一抗稀释度不适宜，太高；加样量过多，弥散至孔周围了，减少上样量或者使用5X上样缓冲液。

1.清洗次数不足，非结合抗体未完全洗净

需要增加洗膜次数和/或洗膜时间。

2. 膜在实验过程中风干

确保膜在 WB 实验过程中不会变干。

3. 曝光时间过长

降低曝光时间，设置不同的检测时间点，逐步曝光。

4. 检测试剂太灵敏

在纯水中稀释检测试剂或使用灵敏度较低的检测试剂。

可能原因：

1. 封闭时间不足

改善方式：增加封闭时间和/或温度，增加封闭剂的浓度(尝试增加至 10%)，更改封闭剂(脱脂牛奶或 BSA)，在抗体缓冲液中加入封闭剂(也可增加封闭剂浓度)。

2. 使用了错误的封闭剂

当检测磷酸化蛋白时，不推荐用脱脂牛奶作为封闭剂，因为牛奶和酪蛋白中富含磷酸化蛋白。

3. 抗体浓度偏高，导致非特异性结合

改善方式：降低一抗或二抗的浓度，在抗体缓冲液中加入封闭剂，做去除一抗的对照实验以判断二抗的特异性。