实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问内参的扩增曲线没有平台期，FAM通道没有问题，这个结果是否可以采用？

bamboopiggy

做realtime一般 pcr的cycle是40，你设置的太少了。还是改一下，用40个cycle，然后看CT值吧

3 回答285 围观

问基因芯片检测是如何实现高通量的？

xuchanglu88

这个是通过一个芯片设计很多个基因的探针实现的。而现在提到高通量，一般是通过二代测序技术实验的，基因芯片技术也逐渐被二代测序替代。

3 回答693 围观

问怎么设计构建能产生出circRNA的质粒？

bamboopiggy

因其独特的首位相连结构，可以让其更不容易被核酸酶降解，有着比线性RNA分子更长的半衰期。现在主流认为circRNA形成主要有以下三种方式：A：侧翼内含子自身互补配对; B：RNA 结合蛋白驱动; C：mRNA 前体剪接时外显子跳读形成套索。第五代circRNA过表达载体有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR，

4 回答1619 围观

问多重PCR怎么优化，有什么好用的软件吗？

bamboopiggy

我喜欢用neb的Golden Gate 克隆组装设计软件 NEB Golden Gate Assembly Tool，其实用哪个都差不多，你只是要平衡一下退火温度。

3 回答755 围观

问在dna扩增中，向pcr反应中，加入DMSO作用

bamboopiggy

DMSO可以降低DNA的二级结构，所以通常在扩增GC含量很高的基因样本的时会添加。但是，DMSO 也会大大降低Taq 聚合酶的活性。所以，大家要权衡好模板的accessibility和聚合酶的活性。

3 回答2808 围观

问反转录时，对于长片段，使用oligodT好呢，还是特异性引物好呢？

天一湖医者

一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾，且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT；但如果你的目的mRNA没有playA尾或者你的基因较大时，由于RT酶的扩增能力问题就要用随机引物。

3 回答639 围观

问扩增长片段DNA, 使用高保真酶和普通的普通Taq酶，哪种更容易扩增呢？

bamboopiggy

两种酶都容易扩增，但是看你的实验目的，如果要做克隆，则需要用高保真酶，防止突变，如果只是做鉴定，可以用普通Taq 酶

5 回答687 围观

问一个质粒的双酶切，两种酶buffer一样，同时切胶。跑胶时，一个小片段看不到，大概600bp，怎么办？根据Marker把需要的4

bamboopiggy

第一步先确定你的酶切的酶没有所问题，所以要做两个单酶切的对照，然后看单酶切和双酶的长切片段的大小，如果有差异，说明酶没有问题。否则重新买酶。第二步，一定要胶回收，需要去除乙醇沉淀带进去的杂质，否则会影响下一步的连接

4 回答951 围观

问PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶

bamboopiggy

蓝斑说明没有连接成功，NEB公司的酶，不需要酶切那么长的时间，并且酶切后，你跑胶鉴定了么？如果有条带，再进行胶回收和连接。一般QIAGEN quick spin column的柱子出问题的可能性不大，最大的可能就是你酶切完，没有跑胶鉴定。

3 回答829 围观

问文献上用的是NLS(十二烷基肌氨酸钠)提取的，我们实验室没有，所以就用了SDS(十二烷基磺酸钠)提取，但是提到SDS法的论文是同

bamboopiggy

SDS是一种非常高效的表面活性剂，几乎可以使所有的蛋白质溶解。它可以破坏蛋白质的非共价键，从而使蛋白质变性，并丧失天然构象和功能。SDS以质量比1.4:1与蛋白质结合（或一个SDS阴离子结合二个氨基酸分子），因此即使蛋白质样品处于等电点，SDS也能掩饰蛋白质的带电情况，使其带负电。这是被广泛使用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理所在。通常，为了在SDS存在时完全裂解细胞，样品必须经过超声处理或若干次通

3 回答4391 围观

问如何使用KeyPro污染净化仪防止RNA的降解和保证PCR的结果

bamboopiggy

确定不是打广告？KeyPro™KP100生物污染快速净化仪采用SLM™专利技术将LED阵列，光学元件和热冷却技术集于一身，可最大限度地提高消毒和去污性能。进行污染的消除，无残留，免冲洗，可节省高达90％的化学去污时间和成本。只需将适用的试剂和溶液，在加入样品前进行净化即可。产品特点： > 触屏操作，简单易用> 5分钟完成去污操作，通量高> 完全灭活污染物> 稳定，一致的效果

2 回答430 围观

问试剂盒提取质粒后电泳一片弥散，无目的条带，这是哪个步骤出问题了？

bamboopiggy

感觉是你没有连接成功，平板上长的都是杂菌。你下次做个不加连接产物的阴性对照看看，如果和阴性对照长的差不多，那就是连接产物要么没有连接成功，要么没有转到大肠杆菌里去。

3 回答1338 围观

问各种基因的模板质粒应该到哪里买，怎么买？有些实在是没办法用cDNA再pcr扩增出来出来，但是用模板扩增的就很好，这是怎么一回事？

bamboopiggy

一般网上有公司可以买，你也可以去addgene上看看，那个比较全。 cDNA是rna反转录得到得，并不是DNA得全长，而是长度不同的cDNA的一个mix，所以做RT pcr的时候，两个引物之间的距离一般是50-200bo

3 回答366 围观

问同一批样本,两次反转录成的cdna，为什么rt-pcr差异那么大？是反转录试剂新旧的问题吗？

bamboopiggy

1.你两次反转录时间间隔多久？时间长了，本身rna就会有降解。2.你反转录的效率每次和每次也是略有差异的，

3 回答1294 围观

问为什么产生了非特异性条带?

天一湖医者

1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度，可以分梯度进行。2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体，单克隆位点的抗原表位是唯一的，多克隆位点的表位不唯一。3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量，可以分梯度进行。

3 回答3566 围观

问为什么我的扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅?

bamboopiggy

是所有的都这样么？会不会是1.你胶漏了，2，你的引物不特意，没有得到特异性的pcr产物。

3 回答391 围观

问WB 内参问题为什么两条带？

bamboopiggy

1.GAPDH抗体的特异性不好，出现杂带2，running buffer是否弄错了。3，转膜时，是否胶变性了。

3 回答1026 围观

问请问各位大佬，本人构建了x-pET28a的质粒，转到了C43感受态里，在37℃摇起来了，结果加完诱导剂28℃越摇越澄清什么情况？

天一湖医者

.1工程菌的问题，可能携带的质粒已经丢失，工程菌不具有抗性，建议在诱导前先检测一下质粒稳定性.2.活化诱导时加入的抗生素过低未加或失效，扩大培养时加入抗生素又过量，建议重新配制抗生素.3.加入的IPTG浓度过高.4.培养基的问题，营养不足.

3 回答770 围观

问荧光定量PCR内参没有结果的原因？

dxywode

先做普通PCR，电泳检测，看看目的条带好不好，好的话，再做qPCR，普通PCR做好了，qPCR的结果自然好。

4 回答3068 围观

问感染细胞不同时间点收样，怎么确定什么时候收样？

dxywode

转染的质粒和promoter不同，细胞表达的时间也不尽相同。一般在24-48小时之间。你第一次做的话，就勤快点常观察。

3 回答2607 围观

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