构建好的载体双酶切后，出现四条带，有哪位大佬知道什么原因吗?

质粒上还有相同的酶切位点吧，导致非特异性切割

有没有注意到这四条带分别有多大，有两条带肯定是你的载体和目的片断，其余两条是什么就不清楚。也有可能是污染，或者是质粒提取出现问题，你的质粒有没有问题。

找卖给你质粒的公司要质粒图谱，看具体的酶切位点分布，或者直接对空质粒和PCR产物切割，跑电泳对比。