实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问酶切后DNA连接效率太低是什么原因？

灵枢天问

一、目的片段和载体片段的摩尔比很重要，但你的载体片段有多少pmol,应该有一定的pmol数，一般要0.03-0.1pmol，不能太低，不知道你的量有多少。换一下连接buffer，时间长加上反复冻融会很快失效，建议用新的。二、载体片段和目的片段的质量也很重要，想一下是否你的回收的质量怎样，是用什么方法得到的，如果质量不好，也是很难得到重组子的。还有就是确定一下T4连接酶没问题吧

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问酶切实验过程中遇到的问题？

汤姆卜丽波

从下面几个因素去考虑：1)　酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug λDNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用1λ DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-,

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问QRTPCR结果如何分析

未来9

Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。下面我们用一个公式进行推导过程：（敲黑板，重点！）PCR 产物量 = 2∧ct * 起始模板量起始模板量 = PCR 产物量／2∧ct = 起始模板量 _2∧ - ct待检基因起始模板量 = PCR 产物量 _2∧ - c

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问提基因组跑电泳，亮度不够高是浓度问题吗？

bamboopiggy

看看跟marker的对比，一般亮度不够是浓度问题，但是你上样前，没有测浓度么？

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问想请教WB半干转的电流和时间怎么选择

bamboopiggy

你用的什么公司的机器？公司应该给说明书了，按照说明书来调就好。大分子量的，就时间稍微长一点，小分子量的，时间可以稍微短一点。

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问4T1细胞溅到眼睛里了，对身体会有伤害么？

balalaLy

应该没什么太大影响，细胞属于外源物质，会被机体免疫细胞解决掉。不放心的话及时做好局部清洗，找眼科医生看看。

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问什么情况下需要包被培养板和培养瓶？

balalaLy

一般根据细胞特性或者实验目的考虑要不要包被以及用什么包被。比如我做乳鼠神经元原代培养要用多聚赖氨酸包被，耳蜗基底膜原代培养要用鼠尾胶包被。

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问在做体外哺乳动物染色体畸变的制片过程中，为什么染色效果会很差，基本很浅。而且细胞很难破裂。目前实验室

汤姆卜丽波

注意事项:1.秋水仙素的注射剂量与时间对观察中期染色体的形态影响很大。通常情况下,小鼠按4 P g/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素, 3一4h后处死小鼠,此时观察中期染色体特征明显。注射时间过短或过长,在镜下可见间期细胞多,而中期染色体形态少。如果在显微镜下能观察到50%一80%中期染色体,说明试验操作相当成功。2.制样时用装有2%柠檬酸钠溶液的注射器针反复吹洗。此外要防止注射针头阻塞。3.低渗处

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问老师这个蛋白打下去时候就成团，不好看，什么原因啊

balalaLy

图片看不清。成团的话，可能是loading buffer太粘稠，或者是蛋白液中杂质比如核酸没有去除干净。

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问STC-1细胞传代后多久贴壁

天一湖医者

文献里看到的最快的贴壁是在传代2个小时以后。

5 回答653 围观

问invasion assay之后细胞总是在膜边缘一圈

balalaLy

有没有可能是铺胶的时候量太少了？导致边缘的胶比较少，细胞容易穿过去？

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问细菌发酵液短链脂肪酸的测定

迟C迟

1用气相色谱法进行检测短链脂肪酸中含有羧基，其极性较大，可与气相色谱柱产生吸附作用，从而可影响色谱柱的重现性。因此，在用气相色谱法对短链脂肪酸进行检测前，需先对其进行衍生化。气相色谱中常见的衍生化试剂有 BF3- 甲醇、五氟苄基、苄基溴、N-（叔丁基二甲基硅烷基）-N- 甲基三氟乙酰胺及 1-（叔丁基二甲基硅烷基）咪唑等。进行气相色谱检测常用的检测器为氢离子火焰检测器，但由于待检的生物样品中短链脂

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问用细菌基因组如何分析次级代谢产物？

迟C迟

你可能还会用到次级代谢产物预测网址：https://fungismash.secondarymetabolites.org可进行细菌、真菌以及植物次级代谢产物的预测。

4 回答564 围观

问怎么用基因组编码结构示意图说明得到的是基因全长

迟C迟

还是得根据发表的文章判断，中间少一段是不是内含子啊，如果是内含子无所谓。还有一个办法，翻译成蛋白序列，看蛋白序列是否完整，就能知道是不是得到基因全长了。

5 回答671 围观

问提取细胞的DNA后进行PCR，然后进行电泳，出现了非特异性的条带，可能的原因？

迟C迟

非特异性条带的出现跟引物特异性不高直接相关，建议重新设引物，或者多看文献，看别人发表的用的什么引物。

5 回答266 围观

问可以通过测反转录产物浓度判定反转效率吗？

bamboopiggy

反转的效率一般是通过RT-pcr的方法进行检测的，没人用cDNA的浓度来确定。

6 回答398 围观

问用于酵母双杂交转化的质粒质量要比较高吗？

天一湖医者

是的，用于酵母双杂交转化的质粒质量要比较高。

5 回答551 围观

问质粒提取过程中去蛋白液可以不加么？

汤姆卜丽波

去蛋白液PD可以有效去除残留的蛋白杂质，当宿主菌为endA+（TG1、BL21、HB101、 ET1256、JM101等）核酸酶含量较高的菌株时，强烈推荐使用去蛋白液PD。

4 回答1581 围观

问求助各位老师，我刚开始学习引物设计，在NCBI里搜乳酸杆菌的基因序列，结果有几万条，需要全部粘贴在Prim

汤姆卜丽波

不用全贴看有认证的，然后选择一个，只贴你需要的就可以了

4 回答484 围观

问请高手帮忙看下小鼠主动脉瓣Masson染色如何计算胶原百分比，图中圈出的部分属于主动脉瓣还是心脏？谢谢🙏

汤姆卜丽波

是心脏啊。下面那部分才是主动脉瓣

2 回答1958 围观

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