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        PCR实验引物设计有什么要求?TM值一般多少最合适?

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

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        丁香清香

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        5 个回答

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        汤姆卜丽波

        有帮助

        1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;

        2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过 5℃。

        3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为 72℃左右。

        4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰,且 3’端的碱基一般不用A;引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败,

        5、碱基要随机分布,且引物自身和引物之间 不能有连续4个碱基的互补。

        6、尽量在基因的编码区 (CDS序列)上设计引物,限制基因组DNA扩增。

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        Eason老歌迷

        有帮助

        图片描述图片描述长度至少要16bp,通常为18-30bp。不要内部存在互补序列。

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        bamboopiggy

        有帮助

        引物最好在模板cDNA的保守区内设计。引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间,Tm值最好接近72引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A,最好选择T碱基要随机分布。 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物5′端和中间G值应该相对较高,而3′G值较低。引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性。引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 引物长度一般在15-30碱基之间。引物GC含量在40%-60%之间,Tm值最好接近72引物3′端要避开密码子的第3位。引物3′端不能选择A,最好选择T碱基要随机分布。引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物5′端和中间G值应该相对较高,而3′G值较低。引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。扩增产物的单链不能形成二级结构。引物应具有特异性。

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        天一湖医者

        有帮助

        引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。Tm值在72℃左右可使复性条件最佳,至少要在55-80℃之间。

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        未来9

        有帮助

        原则:

        1、引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

        2、 产物不能形成二级结构。

        3、引物长度一般在15~30碱基之间。

        4、G+C含量在40%~60%之间。

        5、碱基要随机分布。

        6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

        7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

        8、引物5′端可以修饰。

        9、引物3′端不可修饰。

        10、引物3′端要避开密码子的第3位。

        引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右。Tm值在72℃左右可使复性条件最佳,至少要在55-80℃之间。

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