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        PCR程序设定是根据什么来的?

        相关实验:任意引物 PCR

        user-title

        dxy_csamswa8

        PCR程序设定是根据什么来的?有什么关键点?

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        5 个回答

        user-title

        shanshan2113

        有帮助

        pcr程序设定取决于:1.扩增酶的类型,决定变性温度,扩增效率等;2.扩增引物,决定退火温度;3.目的片段大小,决定延伸时间。

        user-title

        周末也要努力呀

        有帮助

        你买的QP试剂盒上的程序设定时间和温度就行啊。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助
        • 1.常规程序

        • 将PCR反应所需的成分配置完后,在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94℃保持30秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般50-60℃之间),一般保持30秒钟,使引物与模板充分退火;在72℃保持1分钟(扩增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环25~35次,使扩增的DNA片段大量累积。最后,在72℃保持3-7min,使产物延伸完整,4℃保存。

        • 2.复性(退火)和延伸温度

        • 复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素,通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法PCR。

        • 3.反应时间

        • 变性步骤一般使用30秒钟,如果模板的G+C含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

        • 4.循环次数

        • 循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为104~105数量级时,循环数通常为25~35次。

        • 平台效应(plateaueffect):PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓度扩增产物变性不彻底。

        • 5.PCR反应液的配制

        • PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样,在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。

        • 对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时,有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时,如果将反应成分分开配制,A管含模板、引物和dNTP,以及调整体积的H2O,B管含缓冲液、DNA聚合酶和水,然后再将两管溶液混合起来,可较好地克服。

        user-title

        未来9

        有帮助

        PCR程序设定依据:

        95度:保证DNA双链解开的温度
        50-55度退火:保证引物结合模板的温度
        72度延伸:结合引物后聚合酶利用游离碱基补齐双链的温度相对的30秒、45秒、2分钟是各自阶段需要的时间循环数:每次循环,DNA数翻倍,最终获得足够多的片段

        技术关键:

        1,控制污染,千万别污染,做好阴性和阳性对照。
        个人见解,最重要的:模板质量;
        2。好的模板是成功pcr的基础;
        4,包括酶的选择、退火温度和时间、合适的pcr方法,以及随后的实验的重要原因;
        3,实验条件,几乎与上个因素同样重要的是:引物设计。其序列、长短和酶切位点的添加,是pcr的效率和特异性,按其重要性排列

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        bamboopiggy

        有帮助

        PCR程序设定是根据酶的说明书和你引物的tm值来确定,关键在于annealing temperture的设定和extension time的设定。

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