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问
设计引物时怎么保留完整的cds区
bamboopiggy
如果要保留完整的cds区,可以保护碱基+酶切位点+cds的start code开始的那一块,保护碱基+酶切位点+cds区的stop code 往前的一段,来设计引物。
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问
为什么我的样品,头一天还可以在显微镜下观察到荧光,第二天就一点也看不到了
whilt-shirt
这是荧光猝灭了,在加完荧光试剂后要加荧光抗猝灭剂
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问
请问细菌浓度用什么方法测定比较好,如何测定?
bamboopiggy
如果你是要数菌的量的话,建议用细胞计数板来计数,OD值只是一个相对值,在0.6-0.8时,菌的状态最好。
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问
噬菌体检测中样品与菌液混合液的水浴起什么作用?
bamboopiggy
水浴起到了活化菌的作用,你的菌可能时间长了,活力不够
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问
为什么我的GAPDH cq值很齐但是microRNA的cq值确相差比较大?
天一湖医者
同时做2到3个housekeeping基因,是个比较好的方法。因为你这里的gapdh显然不太好。
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问
引物扩增以后出现各种多条带,内参条带正常,可能的原因
bamboopiggy
引物不特异,或者是因为annealing temperature过低,出现了非特异结合。还可能是逆转的效果不好。
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问
pcr扩增中出现的非特异性条带
Eason老歌迷
一般出现非特异性条带,我们可以用下面的办法解决,降低引物和聚合酶的用量,提高退火温度,或者是采用梯度PCR法,测试能够获得最佳结果的温度退火。如果还是不行,就试试touchdown方法,退火温度从高到低,每隔一个反应温度下降1C或者怎么样的,这样可以便于扩增出特异性更好的条带。当然,如果模板可以纯化一下,或者重新制备,也可以避免有非特异物质或者是降解的片段干扰。总之就是先优化。实在不行需要重新设计
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问
18T质粒测序结果比对不上
天一湖医者
1、测序结果比对时候,选用反向互补;如果依旧不对,2、可能是没连上去,因为PCR能扩出条带,不一定就是你目标条带,PCR不严格,不能完全说明问题。此种情况,建议,挑选多个单克隆,进行PCR,挑选最亮的且条带大小一致的送去测序。
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问
pcr扩增中用到的DNA聚合酶有哪几种,怎么选择用哪种?预混的好,还是自配的好
bamboopiggy
有做普通pcr的rTaq酶,也有做克隆的,高保真的LA taq酶等等好多,主要看你的实验目的是做genotyping还是做克隆,如果做克隆,根据你片段的长短,也可以选择不同的DNA聚合酶。至于要用预混的还是自配的,也是看你的实验目的,预混的方便,自配的,可以加入一些提高克隆效率的Mg2+或者DMSO,这一切都是根据实验目的。
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问
定量pcr时 重复性不好,我应该从哪些方面找原因呢?
天一湖医者
主要是加样要特别仔细,比如打出液体时确定打完,移走枪头时不要粘附液体。加样完成后顺时离心,保证液体都在底部。pcr管选择质量选择很重要,次品不可以做定量。因为它的均一度不够。
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问
同源重组构建质粒求助
天一湖医者
回收完跑胶测浓度了吗 ,错误一般是亮度太低浓度太低。
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问
细菌质粒构建如何确保准确
天一湖医者
保存质粒用的菌宿主需要小心选择,因为有不少菌株已经工程化,有些缺失了某些纠错系统,有些则还保留着重组体系。典型的是最好不要用表达载体保存质粒,如BL21(DE3)就不适合,由于其没有缺失重组酶RecA。具体可以看各菌株的基因型。常用于保存质粒的菌株有DH5a, XL1-blue, TOP10等。
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问
跑PCR,遭遇没有目标引物序列出现
天一湖医者
你拿到的测序结果,是从引物开始后面30-50个碱基以后开始的序列,引物序列是看不到的。这个和测序机器的性能有关。一般从引物开始的一小段序列出峰会很不稳定,有稳定峰图可以读出序列一般都是20-30个碱基之后了。你手头若是有峰图结果你看看最开始那段的峰图就知道了。至于拿到的序列到底是什么,ncbi上blast一下不就什么都知道了
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问
WB没有目的条带,咋回事
天一湖医者
蛋白提取的不好;样品保存不当;处理条件不对;甚至有些WB操作问题等等
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问
质粒过表达1000多倍,这正常吗???
灵枢天问
正常的。如果本身表达够低,这种情况就很正常
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问
建立过敏性鼻炎小鼠模型时,年龄选择有什么依据(详细)?不到年龄或者过了年龄有什么影响?
天一湖医者
年龄选择一般为6-7周,具体可以参考https://wenku.baidu.com/view/34d604dd0a75f46527d3240c844769eae009a324?bfetype=new
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问
NEAT1基因有两个转录本,长的转录本是在短的转录本基础上的延长,这种情况下怎么设计针对短转录本的特异引物?
Eason老歌迷
NEAT1基因其实有两个转录本:NEAT1_1和NEAT1_2, NEAT1_1(3.7 kb in humans, 3 kb in mice)与NEAT1_2 (23 kb In humans, 20 kb in mice)的5’末端完全重合,两个转录本均只包含一个外显子,而且均留在核内。NEAT1_1多聚腺苷化,类似于mRNA,而NEAT1_2对paraspeckles至关重要,构成其“arc
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问
sybr Green、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择?
Eason老歌迷
还是根据你实验室的条件,和你自己的个人习惯进行选择。我们比较喜欢用sybr green,便宜好用
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问
探针法多重PCR,扩增时,各条探针平台期荧光信号强度相差大,有必要使信号强度一致吗?
Eason老歌迷
并不需要!但是如果你以后想荧光信号差不多一致的话,可以注意下面的几个点:确保加样的准确性,确保移液的精准度,体系混匀并进行离心,qPCR试剂的选择:选择“预混液”形式的qPCR试剂,反应体系只需加入引物和模板,大大简化实验的操作步骤,减少了加样误差。
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问
BPGA泛基因组分析
bamboopiggy
对,是你的软件安装有问题,估计是版本和你的电脑不match
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