实验问答

21,991,219 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

全部

细胞

问PCR跑胶条带还可以，切胶回收浓度是负的.

balalaLy

回收试剂盒试剂有没有弄混，溶胶的过程胶有没有完全溶解，回收最后一步建议用50度左右的buffer溶解产物，可以加大产物得率

4 回答822 围观

问求大神给分析一下pcr失败的原因

dxy_g9y5gije

考虑三个方面第一是DNA，内参基因验证第二是TM值，设置温度梯度第三是引物，多试几条引物挨着验证

4 回答366 围观

问如何判断pcr样本是否污染，怎么避免？

dxy_g9y5gije

pcr样本污染是指模板污染还是整个体系污染呢如果是体系，那么做好阴性克隆和阳性克隆就可以判断如果是模板的话，考虑重新获取模板比对

3 回答449 围观

问做了三次qpcr独立重复，前两次都有相同趋势，第三次出现了严重反差，实验过程是没问题的操作也很严谨，这种情况要怎么办呢

dxy_g9y5gije

遇到这种情况建议详细记录实验过程再次尝试，因为导致这种结果出现的情况太多了，需要逐一排除

3 回答744 围观

问当PCR产物有两条带的时候，怎么才能快速提高特异性？

Miracle星

出现多条条带表示PCR反应的特异性不高，可以进行如下优化尝试：1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高，DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。2.检查一下引物的Tm值和序列结构，如果引物Tm值过高，上下游引物Tm值相差太大，或者引物单链易形成高级结构，都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。3.检查一下模板纯否。模板越纯，条带越特异。反之模板杂乱（例如cDNA文库

3 回答761 围观

问我是要扩增一个片段，加上双酶切位点，片段就那么大，我就需要那么大加酶切位点？这引物怎么设计？是不是只要5‘端序列，以及3’端的反

dxy_j7jezao0

5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段，网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计，符合一些引物设计原则就好

4 回答866 围观

问普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别

dxy_j7jezao0

qPCR为保证扩增效率，产物片段较小，70-250bp,TM值一般60左右其他差别较小

4 回答3115 围观

问实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT

dxy_j7jezao0

下游引物可以，这就是RT中所说的特异引物

5 回答316 围观

问请问 PCR引物长度24点情况下，错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率？

dxy_j7jezao0

不确定，引物特异性主要受3'端序列影响，错配在5'端，影响较小。

4 回答597 围观

问如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针？能够使Ct值小一点，荧光强度值大一点

Miracle星

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修

2 回答371 围观

问qRT-PCR模板稀释比例一般为多少啊？

cq2019

我都是按照1：5的比例来稀释，跑出来的结果非常好

6 回答1858 围观

问定量Pcr时候怎么减少加样导致的误差

cq2019

为了尽量减少由于加样导致的误差，可以把混合液加完后，最后再加cDNA，加的时候枪头不要深入液体面，同时每加一个孔都要换枪头，最后2000r/min离心

5 回答2058 围观

问求Bacmid BMON14272 图谱或序列

bamboopiggy

你可以参考一下这个公司给的说明书，他们不让我贴连接，我把pdf的头给你贴上。你自己找来看看吧

1 回答1507 围观

问已经逆转录之后的cdna，化冻以后上样扩增之前可以涡旋吗？

cq2019

cDNA还是比较稳定，可以瞬时涡旋震荡的

5 回答2062 围观

问融合蛋白之间，可用两个酶切位点代替linker吗？

Miracle星

不可以的简单的说：1.要遵循引物设计的基本原则,，重组表达的引物相对容易设计一点（因为位置固定）； 2.目的产物是：蛋白1+linker+蛋白2，则需插入载体的目的片段为“酶切位点1+蛋白1+linker+蛋白2+酶切位点2”3.那么想获得这个目的基因片段，则需要设计4个引物，分两步进行。1）引物：P1——> 5'- 内切酶1+蛋白1上游 -3' （正向序列）

3 回答1687 围观

问免疫共沉淀实验，总是假阳性，该如何避免

天一湖医者

免疫沉淀的假阳性一般來自洗过的免疫沉淀物中存在的某些蛋白质,这些污染物在完整细胞内不与目的蛋白相互结合,但在细胞裂解后可形成非生理条件的蛋白质与蛋白质的相互作用,也可能来自抗体与其他非目的蛋白的交叉反应,(这在做western很常见),或者非特异性反应.为了排除这种假阳性可采用几种方法:一是采用几种不同抗体.如用几种不同的cmyc抗体去IP,可增加结果的可信度,另外也可以采用对照抗体,如与你的抗体

3 回答990 围观

问CFW荧光染色染尖孢镰刀菌菌丝染不上怎么办？

bamboopiggy

是不是你的溶液A失效了？你试试延长一下溶液A染色的时间？增加到2min试试

3 回答470 围观

问用0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，给药体积0.1-0.2ml/10g，剂量为多少mg/kg？

天一湖医者

用0.3%戊巴比妥钠麻醉小鼠，给药体积0.1-0.2ml/10g，剂量一般是40mg/kg左右.

3 回答4705 围观

问基因敲除后验证问题。

天一湖医者

首先你要考虑，你所加的抗性浓度是否足够，在你要做的细菌中的抗性浓度与所使用的浓度不是一致的。其次，你的自杀载体真的进去了吗，电转真的转化进去了。再者你要双交换或者单交换的同源区有多大呢，不同菌对同源区要求很不一样；

2 回答992 围观

问药物处理后流式测凋亡

Miracle星

首先你调整一下吹的程度，就是把之前的力度减小一些，试试再做一次对比一下，然后你再用不同的浓度再改变重新做一下。这样就知道到底是什么原因了。

3 回答653 围观

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

实验小助手

扫码领资料

反馈

TOP

打开小程序