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问
求助,wb糊成一片
府宅
样品量太大了,不论是胶还是膜,承受能力都有限度,这样跑胶蛋白会连成一条线,转膜时候,单位面积的膜能hold的蛋白量是一定的,相同分子量的蛋白太多,目的蛋白的转膜效率可能很受干扰,倒是建议你0.2的PVDF,降低蛋白上样量,提高一抗浓度
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问
将含有环状RNA序列的连接产物转化后挑选数个单克隆摇菌提质粒,双切鉴定有目的条带,这些阳性质粒之间会有差别吗?
迟C迟
阳性克隆只是含有抗生素那段序列,成不成环不能保证,还需要再在阳性克隆里面挑选你要的。
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问
input可以做出来,IP一直拉不下来是什么原因
汤姆卜丽波
是不是抗体用的不对,或者两个蛋白之间互作不大
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问
请问在做植物细胞悬浮培养时(百合),如果要将愈伤组织分散,所用的酶有哪些,对应的用量是多少呀?浓度和用量之类的。
迟C迟
用果胶酶和纤维素酶。称取25mg蛋白酶粉配制成25ml酶溶液,每次用100-200微升就可以。
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问
wb实验bca定量做了之后内参依旧不齐怎么办😶
Eason老歌迷
BCA测定的是组织内总蛋白的量,但是由于组织内细胞类型比较复杂,所以所测定的某一特定蛋白的浓度并不准确,以所测浓度作为参考电泳,若结果内参不齐,可以根据各条带的灰度对上样量做适当调整,也就是调内参。若是细胞样品的话,BCA测定结果就比较准确了,跑出来基本上内参都是齐的。实在不行做标曲。
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问
做完转录组学后,必须要做q-pcT昨做验证吗
迟C迟
看文献吧,一般需要再次用qPCR验证一下公司做的转录组数据准不准确的。
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问
pcr实验扩增曲线重复性不好怎么办呀~
迟C迟
1、引物特异性不好,扩增出多个目的条带会有波浪形扩增曲线。2、严重的蒸发会呈现先上升后下降的曲线,轻微的蒸发会是一种缓慢的上升,这些异常的曲线可以看一下检测后的反应管液面是否有下降的现象来证明。
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问
怎么判断感受态细胞是否好用,每次做转化都要两天才能长出来,是不是感受态的问题,质粒是18T载体,超级好连接的那种?
迟C迟
用酶切、PCR、测序 等方法验证长出来的菌落是否正确。可能是这一批感受态细胞活力不好,或者是培养箱温度不正常等等因素导致生长缓慢。
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问
慢病毒细胞稳转时间多久最好?
天一湖医者
慢病毒细胞稳转时间16-18小时最好
3 回答
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问
构建质粒时,什么标签可以防止包涵体的形成?
bamboopiggy
重组基因在表达宿主中表达量过高或合成速度过快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确配对,导致蛋白以包涵体的形式存在。所以你要调整你摇菌的速度和温度
2 回答
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问
用大肠杆菌纯化蛋白时出现包涵体怎么办?
迟C迟
可以用尿素(8M-10M):尿素溶解不电离,呈中性,成本低,蛋白复性后除去不会造成大量蛋白沉淀;溶解后的包涵体可选用多种色谱方法纯化。 或者用盐酸胍(6M-8M):溶解能力强,高达95%以上的溶解作用。
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问
WB实验内参不齐,怎么校准?
宁儿小贤
提完蛋白之后做一下BCA蛋白定量,将总蛋白调整到同一量级,例如都是七八百,或者都是一点几,一般上样之后就没问题了
10 回答
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问
自带发光基团的抗体都会串光吗?实验室买的PH3就会串光,只能避开串光的波长来做实验
balalaLy
串光的话可以根据共染的几个荧光光谱适当缩小一下
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问
冷冻切片一般厚度是多少,多大厚度不影响染荧光抗体呢
balalaLy
看你的是什么组织。切片的厚度一般都是越薄越好,像脑组织可以切到6um左右就挺不错了。但是有些组织太薄了一方面不容易切,另一方面可能观察不到某些结果
4 回答
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问
悬浮细胞怎么做激光共聚焦荧光显微镜?
bamboopiggy
可能你有荧光的细胞少,你可以考虑把细胞用促贴壁试剂贴到玻片上做。
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问
慢病毒转染细胞后筛选抗性基因的细胞需要怎么判断?
bamboopiggy
一般需要筛两周左右没有死细胞了,就可以了
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问
慢病毒转染细胞的时间多长?
bamboopiggy
最少48小时,我一般感染72h,甚至更长时间,看细胞的密度
3 回答
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问
沙眼衣原体感染细胞的实验需要在什么等级的实验室进行啊?
天一湖医者
沙眼衣原体感染细胞的实验需要在二级的实验室进行。
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问
PCR实验中,我的目的条带有出来,但是野生型的条带却未出来,这是为什么?
迟C迟
首先要确定野生型和你的样本之间目的基因的差异,是不是你的样本目的基因存在特异性,野生型就无法扩增出特异的目的基因。
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问
流式分析细胞凋亡实验中如果消化贴壁细胞前用PBS清洗,那不是把凋亡细胞都洗掉了吗
我不是药神88
流式处理细胞的时候,pbs要轻柔冲洗细胞1次,目的是为了去掉培养液(含血清的),以防止血清终止胰脢的消化;这之前倾倒培养液之后,用pbs处理1次细胞,并不会对起产生特别大影响,注意不要用枪头直接吹打细胞,这样基本上不会影响实验结果。过度吹打细胞会造成细胞机械性死亡。
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