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        WB实验内参不齐,怎么校准?

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        Mani-F

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        10 个回答

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        宁儿小贤

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        提完蛋白之后做一下BCA蛋白定量,将总蛋白调整到同一量级,例如都是七八百,或者都是一点几,一般上样之后就没问题了

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        Eason老歌迷

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        有好多种情况会导致内参不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。PAGE胶的制备也很关键。看到条带信号连在一起,一方面因为胶不好,样品扩散,另一方面蛋白表达量 高,曝光时间长。

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        迟C迟

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        内参跑不齐一般是跑胶时电流或电压太大,还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐,试试降低电压,延长时间,纯化样品。

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        whilt-shirt

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        用image j计算灰度值,根据灰度值校准

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        小麦8201

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        第一,应该确认每个样品表达GAPDH的量一样,虽然是持家基因,本人觉得不同细菌可能表达量不一样,造成信号强弱不一样。可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异,调整上样量一样再检测GAPDH。

        第二,内参跑不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。

        第三,PAGE胶的制备也很关键。看到条带信号连在一起,一方面因为胶不好,样品扩散,另一方面蛋白表达量 高,曝光时间长。

        第四,转膜的效率会不会是不一致的,一抗、二抗的接合GAPDH不好。都有可能。

        第五,做过多次WB还是不行,建议新鲜制备蛋白样品。

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        Guoood

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        建议蛋白变性前测定蛋白浓度,我用的是BCA法,配好标准品,准确定量后再进行蛋白变性,跑内参基本就齐了。

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        yanlai000

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        确保上样量一致,加样尽量加靠中间的孔,根据分子量大小适当调整电压

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        bamboopiggy

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        用image J 读一下灰度,然后以比较中间的那个灰度值为准,高的按照比例少上点样,低的多上点

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        天一湖医者

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        提好蛋白后,都会先去测浓度,然后再去loading ,变性。最后根据每孔上样量(质量)一致,去计算上样所需体积。这样跑出的结果,内参理论就会一致。

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        balalaLy

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        算灰度值,根据灰度值调整,可能需要跑几次才能调得比较好

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