求助，wb糊成一片

样品量太大了，不论是胶还是膜，承受能力都有限度，这样跑胶蛋白会连成一条线，转膜时候，单位面积的膜能hold的蛋白量是一定的，相同分子量的蛋白太多，目的蛋白的转膜效率可能很受干扰，倒是建议你0.2的PVDF，降低蛋白上样量，提高一抗浓度

试试降低上样量、降低抗体浓度和作用时间

背景太高了，存在非特异性结合，封闭时间长了

你这要么是胶配的没凝好，要么应该就是样品降解弥散严重

可能浓缩的效果都不是很好，浓缩胶浓度、长度等可以调一下，另外上样量可以少一点，上多了条带就很粗，也容易形成拖尾；内参抗体一般按1：5000来稀释

背景有点脏，我觉得你可以用脱脂牛奶封闭的时候，现用现配，搅匀了取上清。你跑的什么，抗体的特异性高吗？你孵一抗二抗的时间是不是太长，现在天气热，可以适当减少二抗孵育时间