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问
内参(β-actin)出现多条带,如何判断哪条带才是actin?
Eason老歌迷
我们都是很清晰的一个条带,因为内参很好跑。你要说内参为啥多条带,如果要是让我想原因的话,我觉得很可能是loading buffer 里面的DTT可能变质了。
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问
内参总是跑不齐该怎么办?
Eason老歌迷
一个是你要确保你的上样量是一样的。然后配胶一定要混匀。还可能是你跑胶时电压设置的问题。
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问
膜蛋白长时间超声裂解是否影响蛋白质酶活等功能?
balalaLy
长时间超声裂解会导致裂解液温度升高加速蛋白降解,同时超声也会导致蛋白质构象的改变。影响蛋白功能
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问
WB转膜后pvdf膜保存。
府宅
一般常用膜保存液的配方为:水﹕甘油﹕亚硫酸氢钠=79﹕20﹕1保存液温度在5~40℃
4 回答
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问
质谱检测到的蛋白质翻译后修饰差异,免疫沉淀无法成功验证怎么办?
Eason老歌迷
目标蛋白的PTMs研究通常需要一个富集步骤,因为修饰蛋白的丰度一般较低。大多数PTMs检测方法都是结合富集策略开发的,以最佳识别、验证和研究目标蛋白中PTMs的功能。你可以提高纯化浓度。
3 回答
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问
免疫沉淀IgG出现条带怎么改进?
Eason老歌迷
珠子少加点,wb抗体稀一点,曝光时间短一点。珠子抗体这些不要贪多,不然容易有非特异性条带
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问
请问各位前辈条带反白是什么原因导致的
Eason老歌迷
你这是二抗孵育时间太长了,你下次缩短一点孵育时间看看。
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问
有个比较奇怪的问题,请问同样用10%的胶跑了两个分子量都是十几的目的蛋白,称为A和B,为什么A蛋白条带很粗,而B蛋白条带正常
bamboopiggy
可能你a蛋白的表达量高啊,b蛋白的表达量一般
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问
请问,为何细胞里和组织里相同蛋白跑出来的位置不一样? 所配的胶等步骤都是一样,而且重复过很多次。
bamboopiggy
你细胞和你的组织是一个种属的?是同一个器官的?不同器官收的蛋白样,可能跑的位置也不一样。
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问
蛋白显影拍出来黑乎乎,不明显是什么原因?
Eason老歌迷
可能是你的封闭时间太短了。也可能是你的抗体浓度太高了,或者孵育时间太长了。
5 回答
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问
为什么有时候WB显影出来的结果跟说明书上的不同?
Eason老歌迷
因为实验条件不一样,肯定会有或多或少的差别,只要不是太大就行。
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问
目前脱脂奶粉封闭,条带背景不是很干净,封闭时究竟是选脱脂奶粉、BSA还是商品化的快速封闭液更好呢?
Eason老歌迷
我觉得脱脂奶粉效果更好,你可以封闭时间长一点,这样会更干净。
4 回答
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问
为什么同一个指标,不同公司的抗体条带位置不一样,有四十几,有五十几版本,如果两个抗体一起孵,不得有两个目的条带吗?
Eason老歌迷
不同公司的抗体,肯定是多多少少有点不一样。如果你两个抗体一起孵,不会有两个条带,但是可能会有一个宽的连在一起的条带。
3 回答
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问
为什么会跑出说明书以外的很多杂带
Eason老歌迷
封闭时间不足。或者是你选的抗体特异性不高。
4 回答
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问
CCK8
府宅
CCK-8的OD值处在1.0左右是比较好的检测结果,对后续实验的稳定性有益
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问
想问问这样种板均匀吗,细胞数目会不会过多?
balalaLy
种板还算均匀,但细胞数就有点多了,24h后都长很满了,细胞太满,一个是你要弃液再加药这个过程容易使细胞脱落,另一个是细胞太密影响药物作用,再加上本身细胞接触抑制,这都会造成你的实验出现误差。
2 回答
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问
western 电泳后前两块胶在marker 左侧又泳出了marker 条带,而后两块胶没有问题,电泳液都是现配后预冷
balalaLy
第一个孔什么都没加的话旁边的会溢散过来,所以最好是加适量的loading buffer
4 回答
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问
请问侵袭实验,铺板36小时后,小室内有一坨坨的东西呢?
balalaLy
应该是上室的聚在一起的细胞,不影响结果的
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问
膜片钳破膜
Eason老歌迷
我感觉细胞状态是最大的问题,另外接触细胞之后压电极的速度和程度也有些关系,前者需要在你培养和转染条件上多考虑,后者就是手感了~~lipo2000说明书上建议的总质粒:lipo是1:2,但我做过条件优化,我转染用的比例是1:1。当然也要看你转多少个质粒,质粒浓度是多少,因为lipo多了细胞容易死。细胞密度我用70%左右,我的是HEK293B细胞,细胞周期较小,间隔时间就稍微短,理论上越接近对数期越好
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问
请问有同盟养过Caco2细胞吗?传第一代还行,慢慢的长不起来了,容易污染,是否是传代过程中的问题,有细胞碎片产生。可以传授经验吗
府宅
Caco-2细胞生长太满对细胞状态影响严重,传代后易碎,死亡。该细胞对Glutamin,Sodium Pyruvate还是有较高要求的,及时添加吧。
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