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问
WB背景很脏怎么办?
申东熙老伯
封闭久一点,可以用牛奶4℃封闭过夜,降低一抗浓度。
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问
如何选择合适的分子伴侣
Eason老歌迷
我认为需要根据你要表达的真核蛋白的特性去选择相应的分子伴侣。常用的分子伴侣有Trx、GST、DsbA等,它们使得许多外源基因能在E.coli里正确折叠,如IL—11、IGFBP-3、INF、 Insulin甚至包括结构复杂的tPA等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白。
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问
内参(β-actin)出现多条带,如何判断哪条带才是actin?
Eason老歌迷
我们都是很清晰的一个条带,因为内参很好跑。你要说内参为啥多条带,如果要是让我想原因的话,我觉得很可能是loading buffer 里面的DTT可能变质了。
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问
内参总是跑不齐该怎么办?
Eason老歌迷
一个是你要确保你的上样量是一样的。然后配胶一定要混匀。还可能是你跑胶时电压设置的问题。
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问
膜蛋白长时间超声裂解是否影响蛋白质酶活等功能?
balalaLy
长时间超声裂解会导致裂解液温度升高加速蛋白降解,同时超声也会导致蛋白质构象的改变。影响蛋白功能
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问
WB转膜后pvdf膜保存。
府宅
一般常用膜保存液的配方为:水﹕甘油﹕亚硫酸氢钠=79﹕20﹕1保存液温度在5~40℃
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问
WB 转膜后的pvdf 膜保存。
秋秋欣欣
放在TBST 里4度保存,几天没有问题
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问
免疫组化结果到底准不准?感觉DAB多染一会儿就阳性了
秋秋欣欣
免疫组化结果准啊,采图的时候肯定要对比着采图对照和阳性都需要看到,才能具有说服力
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问
酵母双杂交Y2H在四缺培养基上有自激活的话,意味着就是自激活吗?
Eason老歌迷
是的是的。一般检测自激活就是将已知基因构建到可以表达BD结合结构域的载体上,表达形成融合诱饵蛋白(bait),将目标基因构建到可以表达AD激活结构域的载体上,表达形成融合猎物蛋白(prey)。如果诱饵蛋白和猎物蛋白发生互作,BD结合结构域和AD激活结构域在空间上极为接近,GAL4转录因子发生重构,恢复了转录因子的功能,可以激活报告基因的表达。通过检测报告基因的表达与否,从而推测猎物蛋白和诱饵蛋白是
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问
trasnswell铺胶不均
秋秋欣欣
铺胶不均可以铺进去之后轻震几下
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问
求助wb不出条带
Ryan_J
我们用的都是实验专用的脱脂牛奶,还有二抗可以降低些,不知道你的推荐浓度是多少,二抗我都是1:10000
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问
真菌中的蛋白提蛋白过程中,留在上清的蛋白很少,通过WB甚至检测不出来,怎么做Coip?
秋秋欣欣
蛋白较少的还你就需要提高蛋白浓度,充分裂解,扩大真菌量
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问
请问慢病毒感染细胞24h后换液加抗生素筛选细胞大片脱落的原因是?
balalaLy
我一般是24小时如果状态太差就换液,换液后第二天才加抗生素。如果状态好就补几ml培养基继续培养到第二上午换液,下午加抗生素。如果还是死很多细胞说明转染失败,重新包病毒吧
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问
wb中的磷酸化蛋白要怎么跑,有没有什么特殊技巧,能跑的好看
秋秋欣欣
磷酸化的蛋白封闭的时候最好用5%BSA
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问
枸杞木虱qPCR选择内参应该用什么啊? 急!!在线等!!
dxy_gwrp7ndq
ICG 数据库中收集了文献报道的各物种、组织细胞适用的内参基因。
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问
困境-想研究脊髓神经元,但是缺乏脊髓神经元的细胞系(小鼠)
Eason老歌迷
有这篇文章,你可以参考一下。’大鼠海马神经元与小鼠脊髓发育过程中神经递质属性可塑性的研究’这篇文章是中科院一个研究生的。
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问
细胞污染还是正常状态?求指点
秋秋欣欣
看你细胞状态挺好的,应该不是污染,可能就是培养基里的一些蛋白质
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问
wb检测,使用B-actin归一化,还是使用用蛋白归一化准确?
秋秋欣欣
Wb检测应该使用内参归一化,可以是beta-actin
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问
转膜时没有气泡,为什么显影的时候会有像气泡一样的空泡而且很大,确定不可能是转膜时有的
Eason老歌迷
转膜没有气泡,可能就是你敷抗体的时候出了问题,是不是你有一部分膜抗体没孵上啊。
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问
CRISPR敲除导致基因组非目的基因丢失怎么办?
Eason老歌迷
我建议你如果有很多基因丢失,你必须要再做一次了。crispr方法会产生丢失现象,具体参看这篇文章,Paul Q. Thomas 等人在 Nature 发表的一篇题为:Large deletions induced by Cas9 cleavage 论文显示,CRISPR/Cas9切割后小鼠受精卵中出现频繁的大量碱基缺失(千碱基量级)
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