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分泌蛋白在细胞内不分泌
做生物的翔仔
首先需要确定是否真的没有分泌。因为分泌蛋白到达培养基后就相当于被稀释,如果没有做富集就很难监测到。建议通过elisa确定是否真的没有分泌。如果真的没有分泌,建议查看质粒前面的分泌信号肽是否完整。
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问
第一次养HepG2细胞,这种形态正常吗?为什么和网上的图片不一样,是因为现在细胞密度太小没长起来吗?
做生物的翔仔
这一定是Hela污染。我们组出现过相同的情况,误认为是HepG2传代多次,然而发现和ATCC照片不同,最终送去做STR结果显示是Hela。
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问
大家好,我的蛋白条带是出现弥散现象了吗?以及,这个蛋白条带有点糊需要怎么改进吗?
做生物的翔仔
我觉得和膜有关系,你可以尝试换其他品牌的PVDF或者是NC。应该会有好一点的效果。此外我们之前的极特殊的蛋白也会出现这样的情况,例如磷酸化TBK1和磷酸化AMPK。
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问
论文投稿时,是所有的结果都要进行三次生物学重复吗?还是重要的结果进行三次生物学重复?
做生物的翔仔
看期刊的具体要求。有些期刊不要求提交原始数据,有些要求提交做图的三次技术重复而不需要平行重复。有些则是需要三次平行重复的原始数据。
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问
请问活细胞成像用的培养皿有什么要求吗?
做生物的翔仔
不可以,必须使用共聚焦小皿。因为共聚焦显微镜通常需要被拍摄物接触的底部小于0.17mm,否则无法对焦。
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问
做铁死亡相关蛋白的验证,在wb收集细胞时需要把上清中的死细胞也收集上吗?
做生物的翔仔
需要,否则内参很难对齐,同时检测的相关指标很难有显著差异。
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问
有没有师兄师姐跑过P-TBK1啊?
做生物的翔仔
在跑,CST家的抗体使用sev激活后条带比较单一好用。
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问
跑了很多次,条带最后都是空白的怎么回事,但是内参又能正常显出来。
做生物的翔仔
BCL2也伤了我很多次,不过后来好歹是做出来了。我们的教训是一定选用PVDF,转膜时间可以短一点。这个蛋白在NC膜上不怎么结合。此外,抗体建议先富裕一下全膜。我们使用的是proteintech的还不错。
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问
WB实验中转膜时只有一块胶要怎么跑?
做生物的翔仔
另一个卡位空着就行,没有必要都加满。
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问
邻近连接分析可以取代wb吗?
做生物的翔仔
我们的经验是可以,你说的应该是可以取代Co-IP吧。我们有些内源蛋白不好抓的就是用Duolink进行补充。
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问
WB实验内参和目的蛋白要在一张膜上吗?这种情况是内参敷完抗体显完影再用剥离液洗掉内参抗体再敷目的抗体然后显影吗?
做生物的翔仔
最差要在一块胶上,转在一张膜后可以裁剪开分别富裕抗体。但是不要两块胶一块内参一块目的蛋白。如果条带距离很近建议洗膜重新孵育。
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问
纯小白,求助!!!请问我这wb结果为什么会这样?(蛋白分子量为50kda),该怎么改进?
做生物的翔仔
个人认为抗体问题比较大,建议更换抗体。
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问
最近这段时间新配的running buffer稍微放半小时就变浑浊,放到瓶里就像流沙的感觉一样,是因为SDS变质了吗?
做生物的翔仔
建议检测配置用的水的pH值,我们曾经出现过类似的问题。但是我记不太清楚是要求碱性还是酸性了,你可以自己探索一下。
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问
Coip琼脂糖珠法最后用2X上样缓冲液煮完蛋白以后,还需要再离心去掉beads,取上清吗,还是直接用有beads蛋白样跑WB呀
做生物的翔仔
去掉,否则在55/25左右会有杂蛋白出现。
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问
毕赤酵母GS115摇菌出现奇怪沉淀
dxy_02390gsw
请问最后怎么解决?哭死遇到一样的问题
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问
原来可以表达的蛋白现在诱导表达不出来了,请问有没有同学遇到相似的问题,最后怎么解决的?感谢!
dxy_qqfjs3aq
请问你解决了吗?我最近也遇到了一模一样的问题?
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问
小鼠胆汁取材方法求助
dxy_12e73q35
小鼠跟大鼠都没有胆囊,怎么直接取胆汁了?
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问
什么是MOI?
dxy_8u2vpm02
jjjhgyfddddddddddd
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问
H9C2大鼠心肌细胞 H2O2过氧化氢造模浓度不稳定
balalaLy
过氧化氢不稳定,买回来的过氧化氢要及时分装,每管用一次。
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问
冰冻切片免疫荧光求助!杂信号特别多
Eason老歌迷
出现杂点有几个原因。1、二抗未洗净(再使用PBS多洗几次)2、孵育过程中出现了干燥现象,产生非特异性染色(注意湿盒的使用,避免干燥)3、抗原封闭不彻底(使用二抗同源血清进行封闭,延长封闭时间等)4、一抗特异性问题(换抗体,或者多抗换成单抗进行实验)。
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