实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

问外周血提白细胞

loveliufudan

在从外周血中提取白细胞时，可以考虑以下几点：分离白细胞时，应尽可能避免带入红细胞，因为红细胞的存在可能会干扰后续实验的结果。可以采用梯度离心等方法，分离白细胞和红细胞。在裂解白细胞时，应使用足够的裂解液，使细胞能够充分裂解释放出目的蛋白。可以考虑使用含有蛋白酶抑制剂的裂解液，以避免蛋白酶降解目的蛋白。如果白细胞量较少，可以考虑进行富集，例如使用免疫磁珠富集目的蛋白，或者采用增加样品量的方式。在We

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问IP急求，好几次了做不出来

loveliufudan

有以下几点建议：确认蛋白质表达水平首先需要确认蛋白质确实存在且表达水平足够高。您可以尝试增加过表达的细胞培养时间或使用更高浓度的诱导剂来增加目的蛋白表达水平。确认抗体的特异性和工作条件确保使用的抗体是特异性的，并且在所用的条件下（稀释倍数、结合时间、温度等）表现出最佳的特异性和灵敏度。可以尝试使用不同稀释倍数的一抗和二抗，调整结合时间和温度等条件，以优化WB实验的结果。优化IP实验条件在IP实验中

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问做实验练练手，结果有点出人意料

loveliufudan

这种结果可能有以下几种可能的原因：过量染色：在染色过程中，过量的染料会与蛋白质结合，导致颜色过深。如果您在染色过程中使用了过多的染料，那么即使内参蛋白质的上样量最小，它仍然可能出现深色带。实验条件不一致：在进行蛋白质电泳实验时，很多因素都会影响结果，如电泳时间、电压、缓冲液pH值等。如果这些实验条件在不同的实验中存在差异，那么结果也会有所不同。仪器问题：蛋白质电泳实验需要使用一些特殊的仪器，如电泳

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问带MBP标签的蛋白纯化

loveliufudan

MBP标签通常被用于帮助纯化目的蛋白，但是有时MBP标签本身会从目的蛋白中脱离。这可能是由于以下原因之一：蛋白结构域：MBP标签可能位于目的蛋白的结构域中，这可能导致MBP标签在纯化过程中被蛋白酶剪切或脱离。蛋白不稳定：目的蛋白可能不稳定，并且在纯化过程中会失去MBP标签。未正确装配：MBP标签可能未正确装配到目的蛋白中，导致MBP标签在纯化过程中被去除。纯化条件不当：使用的纯化条件可能不适合MB

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问同源重组第一次交换后菌落pcr没有带为什么

loveliufudan

同源重组的第一次交换需要确保有足够的质粒模板和恰当的条件。如果PCR没有出现目标带，可能是以下原因之一：质粒模板的浓度不足。如果使用的质粒量太少，PCR扩增可能不足以产生足够的目标带。建议使用更高浓度的质粒模板，并在PCR反应中增加扩增周期数和/或使用更高灵敏度的PCR酶。PCR反应条件不恰当。PCR反应温度和时间以及PCR缓冲液成分可能影响PCR扩增结果。建议调整PCR反应条件，尝试更多的PCR

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问荧光定量pcr数据

loveliufudan

RQ（relative quantification）是相对定量分析中的一个指标，表示目标基因表达量与参考基因表达量的比值。RQmin和RQmax是RQ的最小值和最大值，通常用于评估相对定量结果的可靠性。关于RQmin和RQmax的计算方法，通常会根据实验的具体设计和分析策略而有所不同。但一般情况下，它们是根据样品的Ct值以及参考基因的表达稳定性指标（如ACtSD）计算得出的。下面是一种计算RQm

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问荧光定量NTC有峰值

sswei

反应体系组分（如，水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验;标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。

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问引物设计

loveliufudan

设计pre-miRNA和pri-miRNA的引物需要注意以下几点：确定目标序列：首先需要确定目标miRNA的pre-miRNA或pri-miRNA的序列，可以通过基因组浏览器等工具获取。引物长度：通常选择长度为18-24bp的引物。Tm值：引物的Tm值需要在50-65摄氏度之间。特异性：引物需要具有较好的特异性，避免引物与非目标序列的杂交。引物设计软件：可以使用一些在线或离线的引物设计软件，例如P

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问A549细胞转染

sswei

通常情况下，对于24孔板的DNA转染，每次用2μl左右，则1.5mlLipo2000约可转染750个孔；对于24孔板的siRNA转染，每次用1μl左右，则1.5mlLipo2000约可转染1500个孔。

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问如何考察核酸检测方法的灵敏度

loveliufudan

为了考察核酸检测方法的灵敏度，可以使用不同浓度的DNA或质粒来检测，并确定方法能够检测到的最低浓度。不同的基准可以用来考察不同类型的核酸检测方法的灵敏度。DNA浓度(m/v)：对于基于荧光染料或凝胶电泳的DNA检测方法，可以用不同浓度的DNA样品来检测，以确定方法能够检测到的最低DNA浓度。质粒拷贝数(copy/v)：对于基于PCR的检测方法，可以用含有不同拷贝数的质粒标准样品来检测，以确定方法能

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问新城疫V蛋白

loveliufudan

新城疫（Newcastle disease）是一种禽流感病毒，也称为鸟流感。V蛋白是该病毒表面的糖蛋白质之一，具有重要的免疫学意义。请提出你的具体问题。

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问双荧光素酶验证实验转染问题

loveliufudan

在进行双荧光素酶验证miRNA是否与靶基因的3UTP结合实验时，您可以选择将报告载体和miRNA模拟物分别配置两个体系进行转染，也可以将它们混合在一起加入转染试剂中。这取决于您的实验需求和转染试剂的使用说明。如果您选择将它们分别配置两个体系进行转染，可能需要更多的转染试剂，但是可以控制每个体系中报告载体和miRNA的比例，从而减少不必要的干扰。同时，这种方法也可以避免miRNA与转染试剂或其他物质

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问二次pcr

loveliufudan

可能有多种原因导致PCR产物暗或者模糊。以下是一些可能的原因和解决方法：反应条件不正确。确保PCR反应体系中的所有试剂品质良好，反应条件正确。如果反应体系中某些试剂的质量差，可以尝试使用新的试剂来重新制备反应体系，如果条件不正确，则可以调整反应温度、时间和引物浓度等参数。降解的DNA模板。如果模板的质量不好，例如DNA受到过度酶解、酸碱条件不佳等等，可能会导致PCR产物的低浓度或者失真。可以尝试使

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问RIP结果分析

loveliufudan

在 RIP 实验中，IP 组通常是指经过免疫沉淀后的 RNA-蛋白质复合物样品，也称为 IP（immunoprecipitation）组，而 Input 组是未经过免疫沉淀的总 RNA 样品。根据 RIP 实验的原理，IP 组中的 RNA 应该是与特定蛋白质结合的 RNA，因此相对于 Input 组，IP组中 RNA 的含量可能会更少，CT 值也可能会更高。不过，这个结果也可能受到实验条件、抗体质

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问基因变异位点有RS号,但是未有文献报到过,算新变异吗?

sswei

通过对新变异位点结构、功能等情况进一步研究来说明。

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问人脐静脉内皮细胞细胞培养问题

loveliufudan

很明显出现了细胞污染，可以考虑以下几个步骤来处理：立即停止污染的培养，将培养皿或培养瓶标记为“污染”。在进行任何处理之前，首先应该确定污染的类型，可能的来源和污染的程度。常见的细胞污染类型包括细菌、真菌、酵母、病毒等。在更换培养基、加入抗生素等处理之前，需要将培养皿或培养瓶里的细胞全部清除。可以使用一些消毒剂，如70%的乙醇、2%的次氯酸钠溶液等，对培养皿进行消毒。消毒剂使用前，应该先试验不同浓度

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问二硫化物应激

sswei

由细胞内过量胱氨酸积累引起的二硫化物应激导致的快速死亡方式。

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问请问大家牛垂体提取物都用什么溶解啊

loveliufudan

牛垂体组织提取的溶解液可以根据不同实验需求选择。以下是一些常用的牛垂体提取液：RIPA缓冲液：含有1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 8.0。该缓冲液适用于提取膜蛋白和可溶性蛋白，可以用于Western blot、免疫沉淀等实验。RIPA缓冲液含有高盐浓度：含有1% NP-40、0.5%

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问请问为什么酶联免疫测定细胞无血清饥饿后细胞培养上清的酪蛋白浓度时，变化忽高忽低

loveliufudan

在酶联免疫吸附实验中，饥饿处理可以影响细胞代谢和生长，从而可能影响到上清中特定蛋白的浓度，其中包括酪蛋白。因此，酶联免疫测定细胞无血清饥饿后上清中酪蛋白浓度的变化是可以理解的。饥饿处理可能导致细胞代谢的变化，如能量代谢的降低、蛋白质降解的增加等，这些变化可能影响到酪蛋白的分泌和稳定性。此外，细胞在饥饿条件下可能会分泌不同的细胞因子，这些细胞因子可能对酪蛋白的分泌和稳定性产生影响，从而导致酪蛋白浓度

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问L-色氨酸如何加入LB培养基

sswei

色氨酸一般是在稀酸或稀碱溶液中溶解，然后加入培养基。

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