实验问答21,902,784 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问结果出现了非特异性着色的问题，是实验的哪一步出了问题，需要怎么改进？

菲菲飞呀飞

1.非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果2.缩短 DAB 孵育时间或降低 DAB 浓度/过氧化氢浓度等；3.适当增加 PBS 冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤为重要；4.防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色

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问DAB-H2O2 显色的时间过长了，显示的结果不太好，有什么补救方法吗？

煤球儿啊

重做一次比较好，新片子重做比较好

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问孵一抗是4度过夜还是37度2小时的效果好？

迟C迟

这两种方法都可以，一般过夜4度是实验时间太长来不及做完，第二天继续，你来得及可以37度两小时。

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问孵一抗的量是按组织面积还是体积计算？大概量为多少比较合适？

dxy_61kek75

按照面积计算，且在可以染出目的抗体的基础上尽量减少抗体浓度以减少由于边缘效应造成的组织边缘非特异性染色以及背景颜色非常强（也可以节省抗体），抗体稀释液可以覆盖组织一即可，不过，最主要的是防止染色孵育的时候抗体液风干，导致背景以及非特异性染色增强

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问抗原修复如果使用EDTA修复法，用多少浓度的EDTA呢？

菲菲飞呀飞

EDTA的最佳浓度为1.5mg/ml血液，如果血少，中性粒细胞会肿胀分叶消失，血小板会肿胀、崩解，产生正常血小板的碎片，使分析结果产生错误。

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问抗原修复如果用高压热修复，具体要求和步骤是怎么样的？

菲菲飞呀飞

玻片要置于金属架上1)材料及试剂。家用不锈钢高压锅。加热板”玻片架放置容器(容量大约400 500ml)’抗原修复缓冲液(TivEDTA pH9.0,构橼酸钠pH 6.0)2)方法1.将合适的抗原修复缓冲液加入高压锅内，然后将锅置于加热板并开至最大功率，此时不要把盖子盖紧。在等待煮沸过程中，进行脱蜡至水。2.煮沸后，将玻片从自来水中取出放入高压锅内。小心热溶液-使用镊子。依照说明书加上加压阀。3.

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问组织切片脱蜡水化时使用的乙醇梯度设置几个比较好？时长控制在多长时间？是越长越好吗？

whilt-shirt

1)水洗后组织于5ml离心管内2) 75%乙醇脱水1 h-2 h或过夜（此步骤可根据实验时间安排选择是否过夜)3)80%乙醇脱水1 h-2 h4)90%乙醇脱水1 h5)95%乙醇脱水0.5 h或者过夜(此步可过夜组织仅限于肝，脑，肌肉等含水量多的组织)6)无水乙醇脱水20 min两次(依据含水量多少，脱水20-60min)7)无水乙醇+二甲苯1:1 20min。(进行过渡，以防脱水不彻底)

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问在免疫组化制片的时候有什么办法能让组织完整无刀痕？脑组织切片厚度多少才是最佳的？

菲菲飞呀飞

想要免疫组化制片的时候让组织完整无刀痕，必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，而产生抗原标记定位弥漫现象

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问免疫科研入门者怎么才能设计好完整的实验？

菲菲飞呀飞

1、明确探究目的和已有条件，制定计划与设计实验的过程。2、尝试选择科学探究的方法及所需要的器材。3、尝试考虑影响问题的主要因素，有控制变量的初步意识。4、认识制定计划与设计实验在科学探究中的作用。注意：1、要明确实验目的，设计的方案要与猜想紧密相连，并且能够验证猜想是否正确。2、要选择合适的研究方法。一般常用的方法有控制变量法、转换法、现象或数据归纳法等。3、要根据需要列出实验器材设计实验步骤和记

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问免疫层析胶体金定量试纸如何确定加样量

whilt-shirt

胶体金试纸条胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。定量的胶体金试纸是通过抗原抗体复合物反应显色，然后再根据灰度值通过拟合的线性方程（灰度和浓度的二元方程）求出灰度对应的浓度值，即检测结果。

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问在做DNA印记之前需要哪些试剂来处理genomic DNA?

whilt-shirt

1 酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸12Mol/L稀释 2 碱变性液,0.5mol/L NaOH，1.5mol/l NaCl pH13.1 3 中和液，0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl 4 20×SSC: 0.3mol/柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0 5 10×SSC和2×SSC 用双蒸馏水稀释20×SSC储存液

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问coip后的结果，怎么判断我的目标蛋白和ip得到的蛋白一定有相互作用呢？

刹那芳华2333

免疫共沉淀（Co-IP）是利用抗原与抗体之间的专一性作用为基础，用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的经典方法。利用免疫共沉淀可以检测两个已知蛋白之间的相互作用，或者利用已知蛋白寻找与之相互作用的未知蛋白，通过wb的阳性条带来判断是否发生互作

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问淋巴细胞培养管的选择 24 48孔

菲菲飞呀飞

淋巴细胞培养既可选择培养板(24、48、96孔、培养瓶，也可选择三角烧瓶、试管等器■进行培养有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml离心管培养72小时细胞生长状况良好细胞数与培养前比较,差异无统计学意义(P 20 05) .用青霉素小瓶进行培养淋巴细胞生长也非常好。可以认为,对散在的细胞培养来说用小器皿具有以下优点: (1)便于操作1.5ml离心管为次性使用，青称崇小瓶可反复刷洗，而培养板、培养瓶价

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问免疫组化结果如何判读？

菲菲飞呀飞

结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在4undefined光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。

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问ELISA试剂在对不同实验的选择上，需要遵循什么样的标准？

Kimser

根据抗体类型选择：首先看是单抗还是多抗，又或者两者结合。顾名思义，多抗能够确保捕获所有抗原，随后单抗再特异性检测拥有特定抗原表位的抗原。所以，我们应该明确捕获抗体和检测抗体所识别的抗原表位不存在重叠。

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问为什么遗传物质就是核酸？

今天摆烂了咩

RNA是单链的，结构不稳定，一旦变异就没有对应的修复机制，而DNA的双螺旋结构可以很稳定的存在，复制。

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问核酸检测的假阴性如何解决?

txs900416

具体因素包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、PCR抑制等。只能多次采样进行检测，并更新技术手段才能避免

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问DNA提取的注意事项有哪些？

闭门羹牛

尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈振荡、搅拌等)，细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，DNase大量释放，样品反复冻融和高温等。

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问实验有时候会出现误差，应该怎么样避免啊

Lv花开花落

1.多次测量取平均值2.使用精度高的仪器3改善测量方法

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问wb实验中如何跑出水平的条带？蛋白拖尾现象怎么避免？

dxy_gwrp7ndq

避免拖尾：可以根据情况调整蛋白量，同时降低一抗的浓度，缩短一抗的时间。

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