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科研学霸天团，48小时有问必答

问怎样根据蛋白分子量配分离胶和浓缩胶浓度？？

府宅

根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制：

10 回答63906 围观

问染色后可以用自动细胞计数器计数吗？

whilt-shirt

可以，染色只是区分活细胞和死细胞，不影响计数

4 回答367 围观

问western做p-AMPK和AMPK时，是先把一种抗体洗脱了再敷另一个，还是可以平行着分别做？

dxy_gwrp7ndq

如一抗种属来源不一致，即使分子量接近的蛋白，只要洗脱够彻底，也不会产生多条带，就可以一起做。

4 回答675 围观

问6.5%的EMSA 胶为什么100V跑一个半小时才能跑到1/2，理论上不应该半小时就跑到吗

dxy_gwrp7ndq

可能是电泳环境的问题，一般电泳大约50-60min，可以根据实际情况调整电泳时间及电压，而且电泳时间不宜过长

2 回答1082 围观

问想用荧光抗体对组织免疫染色，能染出梯度吗？如何对梯度分布的分子进行染色？

天一湖医者

可以的，通过调控镜片在染色液里上下运动的时间的方法进行。

2 回答210 围观

问coip实验中从免疫磁珠上洗脱相互作用的蛋白时，怎样才能只洗脱下来相互作用的蛋白，而不将磁珠上的抗体也洗脱下来？有专门的洗脱液吗

天一湖医者

可在洗脱之前加一步水洗，也可以有效降低洗涤液残留对磁珠洗脱效果的干扰。

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问western blot，最后显影不特异，怎么办。

vae1476

没有特异条带吗？那考虑样本没问题的话，最可能出问题的是一抗，一抗的特异性决定了结果的特异性

3 回答252 围观

问IHC-P,IHC-Fr和IHC-Fl切片固定条件（浓度，温度，时间等）和注意事项有哪些？

丁香粉猪猪

对组织浸蜡时，一般选用56℃~58℃熔点的石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。

3 回答1580 围观

问ChIP实验中最关键的结果是什么？什么样的富集倍数被认为是阳性的结果？

whilt-shirt

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验本身其实就是一个通过免疫沉淀反应验证蛋白与DNA相互作用的实验。因此结果一般包括两个数据：免疫沉淀的效率（富集效率）, 蛋白与DNA结合能力（富集倍数）。但是这两个结果本身都是一个相对值，因为富集效率就是断裂后的染色质分成两部分，一部分进行免疫沉淀，一部分作为对照不进行免疫沉淀，然后两者进行比较，得到一个百分比。富集倍数就是取两个抗体进行免疫沉淀，一个是特异性的抗体

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问ChIP实验中DNA的检测在什么情况下用PCR反应？什么情况下用测序？

dxywode

ChIP实验中，当检测已知蛋白结合的DNA序列的时候,可以使用PCR反应进行检测,因为你可以根据已知的DNA序列，取设计引物，然后进行扩增，看能不能将DNA扩增出来。扩增出来了，就证明你成功的使用抗体将目的基因富集下来。当你不知道结合蛋白所对应的DNA序列时，就要通过构建文库以后，进行测序，然后知道富集下来的DNA序列。

2 回答510 围观

问western目的条带上方还有一条稍细的条带，这种图片能否用于发文章？

丁香粉猪猪

抗体是不是回收重复利用的？重复利用的抗体效价会降低。2.样品是不是放的时间长了？蛋白有些降解，建议重新取样。若不是，可以用以前的样品做个阳性对照。看是否也是这样。3.杂一抗前用5%的脱脂奶粉封闭30min,可以降低背景和杂带。

4 回答275 围观

问ChIP实验中需要选择ChIP级别抗体，没有ChIP级别抗体该怎么选择？如果我的实验种属比较特殊（果蝇，昆虫，植物等）该怎么选择

vae1476

实在没有的话，可以联系公司订制，但时间比较长，急的话，可以拿IP/IHC/ICC级别的抗体进行尝试

3 回答817 围观

问ChIP实验中使用超声方法断裂染色质温度不易控制，可能会使蛋白变性，影响ChIP结果，有没有较好的优化方案？

dxywode

目前，市面上有很多打断仪器是可以持续控制温度在指定温度的。也就是说可以将温度控制在一个比较冷的环境中，这样可以减少你所说的蛋白质变性的可能。同时在打断时可以选择间断循环打断。就是可以减少打断的时间，增加打断的循环数，从而达到同样的打断效果和降低蛋白变性的可能性。

2 回答557 围观

问跑western条带总是中间浅、两侧深的原因是什么？

whilt-shirt

是不是转膜没夹紧导致的，尝试更换新的转膜滤纸

3 回答2713 围观

问蛋白质分离纯化，用什么方法最好？

丁香粉猪猪

一、常用的破碎组织细胞的方法有：　　1.机械破碎法　　这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。　　2.渗透破碎法　　这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。　　3.反复冻融法　　生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。　　4.超声波法　　使用超声波震荡器使细胞膜上

4 回答670 围观

问酶联免疫吸附试验是敏感性很高的一项技术实验，实验过程有哪些需要注意的？与其他实验相比有什么优点？

府宅

注意事项：1.可溶性抗原或抗体吸附于固相载体而成为不溶形式，这是进行酶标记测定的基本条件。许多物质可作为固相载体，如纤维素、交联右旋糖苷、聚丙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑料管。2.包被所用的抗原必须是可溶性的，而且要求是优质和稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。如果不纯，由于抗原中所含杂质就会竞争固相载体上的有限位置，降低敏感性和特异性。此外还应考

3 回答710 围观

问为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？

邓豆豆逗

可能细胞表达量较少检测不到，建议换大皿培养，增加上样量，或者抗体浓度，还有可能确实没表达，重新诱导，同时用流式，elisa等同时检测

5 回答225 围观

问湿转转膜时间与蛋白大小有没有必然联系呢？

迟C迟

有关系的，转膜时间太长，小蛋白会从膜中穿过。

3 回答3088 围观

问蛋白结构探索，什么是蛋白

小布丁瑶瑶

蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构。作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸连接形成的多聚体，在形成蛋白质后，这些氨基酸又被称为残基。蛋白质和多肽之间的界限并不是很清晰，有人基于发挥功能性作用的结构域所需的残基数认为，若残基数少于40，就称之为多肽或肽。要发挥生物学功能，蛋白质需要正确折叠为一个特定构型，主要是通过大量的非共价

3 回答425 围观

问怎么确定上样量呢？怎么计算？为什么WB条带会跑歪，那怎么处理呢？

府宅

这要根据你做的蛋白表达量多少，一般是用DAB显色要50-100μg，用ecl曝光上样量为20-40μg。但根据你蛋白表达量的不同目标蛋白绝对量DAB法至少50pg，ecl法至少20pg。

3 回答1454 围观

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