实验问答21,908,062 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问如何通过DNAstar测序已知序列

迟C迟

DNAstar软件共有七个小程序，MegAlign则主要执行序列比对的功能。开启MegAlign软件首先需要点击File---New 新建一个工作文件，再点击File---Entersequeces 添加需要比对的序列，支持多种格式的文件（.seq;.abi;.pro;.fas等），点Ａdd可添加多个文件，点Done导入选中的文件。点Align选择序列比对的算法，其中多序列比对有三种算法：The

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问如何才能跑满意的蛋白条带？求解决方法

迟C迟

WB实验要做的好，有以下几点需要注意：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个

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问磷酸化蛋白背景深，且无条带

闭门羹牛

确保完全裂解并使用新鲜样本；在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境。磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋bai磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持低温环境！

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问请问，如何控制蛋白条带的灰度呢？

dxy_iel2g9hw

一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件

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问想用一个短肽（5肽）做配基亲和纯化一个可以无他特异性结合的蛋白，用什么做调料比较好？

丁香粉猪猪

可以加点甘油或者乙二醇降低极性，还可以加2%的peg

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问wb实验中预制胶和梯度胶各有啥优缺点，如何选择?

府宅

预制胶只能分离其分离范围内的蛋白质，过大过小都不行，而梯度胶则不存在这种局限性，大分子在顶部分离，小分子在底部分离；由于梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质，而这类蛋白往往在固定胶无法完成分离。预制胶优势：1.电泳时间短，可支持150V电压，30-45min即可完成电泳过程2.边缘效应弱，条带更平直；于 Tri

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问细胞生物标记物检测的方法:WB法和流式细胞仪，单用一个就行?还是必须联合使用

listener0014

另外一个也看经费是否充足，如果不差钱，肯定是越全越好

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问动物组织需要最少重复多少次wb?

dxy_gwrp7ndq

WB实验，收样的时候可以不用做复孔，分装蛋白的时候可以分几份跑胶，也可以就跑一次。但是结果至少重复3次（三批的样本）保证重现性

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问背景杂质多，封闭液用了也效果不佳，有没有好的办法?

府宅

膜过度曝光，以及不足的漂洗都会导致高背景。将膜曝光的时间缩短. 同样的，不充分的漂洗只是需要将冲洗更加充分彻底.，漂洗用来去掉过量的抗体.

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问大分子蛋白总转不出来，该如何调节电泳条件?

dxy_gwrp7ndq

过夜转膜对于大分子量的蛋白还是很不错的，做了370KD的蛋白，100mA过夜18-20h即可

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问条带总有杂带如何破?

dxy_gwrp7ndq

杂带原因：1. 抗原的蛋白水解分解。这种情况并不少见，特别是如果样品储存时间过长，或者在起始组织均质化后分离蛋白质或膜。所有附加条带的表观分子量均低于全长蛋白质。特别易感的是突触蛋白和突触结合蛋白。应考虑添加蛋白酶抑制剂，如 PMSF、胃蛋白酶抑制剂或亮抑酶肽。2. 每条泳道蛋白质过多或检测系统过于敏感。蛋白质免疫印迹法中，凝胶过载是“鬼带”的常见原因之一。固定的蛋白质可以提供一个集中的吸附表面，

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问如何组织样本蛋白防降解？

dxy_gwrp7ndq

在提取时应保持低温状态并加入对应的蛋白酶抑制剂蛋白样本建议加入上样缓冲液煮沸变性后保存，对于稀有样本建议-80℃分装保存，并且避免反复冻存，尽快完成实验

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问如何防止组织样本wb蛋白提取时候降解？

府宅

1、使用蛋白酶抑制剂抑制细胞或组织中释放的蛋白酶活性。PMSF是廉价但高效的抑制剂，因此几乎是所有WB实验中必选之抑制剂。2、提取蛋白时，避开蛋白酶的最适活性温度。所有的步骤都可在低温下完成，所有的试剂都需预冷，以降低蛋白酶活性，防止蛋白降解。尤其是消化系统相关的组织样品尽量取新鲜的样品制备，制备方法选用液氮研磨的方法，将样品降解降到最低。3、加快提取速度。对于组织来说，取样顺序最先取消化系统相关

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问蛋白质的提取方法有哪些？

府宅

1、凝胶层析法凝胶层析是运用碳分子筛功效对蛋白开展分离出来。疑胶是具备三维空间多孔结构多孔结构的物质，历经适度的水溶液均衡后，装进层析柱。一种带有各种各样分子结构的试品水溶液迟缓地流过凝胶层析柱时，大分子物质不容易进到疑胶颗粒物的微孔板，只有遍布于颗粒物中间，因而在过柱时向下移动的速率较快，最开始被过柱。小分子水物质除开可在疑胶颗粒物空隙中外扩散外，还能够进到疑胶颗粒物的微孔板中，过柱时向下移动的

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问临床实验室蛋白定量质谱方法的准备有哪些？

府宅

1.基于Label Free的定量蛋白组分析2. DIA/SWATH定量蛋白组分析3. SRM/MRM/PRM蛋白相对或绝对定量分析

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问重组载体转化大肠、菌p后送测，结果(十个碱基突变)两个氨基酸突变。老板叫换个cDNA模板再做一次，结果二十个碱基突变，什么原因？

丁香粉猪猪

可能酶产物碎了一些，这样连进去就有大有小。如果你引物用的是在载体上的，那很可能扩出大小不同的。如果你引物就是在基因上的，这个好解决，你把退火温度逐渐提高，看看是不是那个不同片段就没了。 2、有的时候发生了片段自连【这个看起来好像很可笑，但其实我发现只要末端有一个碱基配对，时间长的话，片段是可以连接到一起的，这个就跟TA连接实际一样】。 3、你的电泳系统有污染，你把别人的片段给收进去

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问跑出来的条带有不是特异性的一条而是两条挨得很近的条带，是因为抗体特异性不好？

whilt-shirt

好几种可能，你可以更换抗体试试。

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问在封闭缓冲液中加入人表面活性剂，如何选择合适的去污剂？

bqejjh123

好的去污剂首先应该能够充分裂解细胞，溶解其中的蛋白，并对后续的实验研究没有影响。对于想要得到保留天然构想的还是变性的蛋白质，这才是第二考虑的问题。没有一种去污剂可以适用于所有的实验研究，即使应用于同一种实验技术，去污剂效果的好坏还取决于实验所分离的蛋白质（表格1）。因此，通过尝试和失败经验，可以帮助我们找到最合适的去污剂，此外，还可以尝试使用去污剂的混合物。需要再强调的是，配置新鲜的去污剂缓冲液也

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问如何更好的进行免疫细胞的激活和分化？

dxy_gwrp7ndq

可以利用免疫细胞激活培养基将单个核细胞置于所述包被后的培养容器中，以便得到激活的免疫细胞。也可以加入活化液（刺激因子）进行激活

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问Western Blot实验，条带信号弱，难以分辨，怎么改进呢

whilt-shirt

加大上样量或增加上样浓度，更换新抗体或加大抗体浓度

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