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问
怎么让跑出的胶条带比较整齐,不歪歪扭扭?
天一湖医者
可以更换缓冲液!还有就是上样品时样品漂了。
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问
在SDS-PAGE胶跑完之后,为什么要再用考马斯亮蓝染色呢?我们看染色出来的胶是看条带整体颜色均一还是某些条带的粗细一致呢?
bamboopiggy
跑完page胶。如果没有转膜直接考染,就是看蛋白的表达,看条带的粗细,如果是转膜后考染的话,就是看蛋白是否转过去了
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问
细胞水平要做WB,多少细胞提的蛋白够做WB?跟细胞类型有关吗?
whilt-shirt
基本上10^6细胞就够了,可以再多一点
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问
关于膜蛋白SDS-PAGE电泳?
dxywode
先做个western确定下目标蛋白是否表达? 因为膜蛋白表达量教低,即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常。 保证每步都加PMSF或者相应蛋白酶抑制剂 避免被降解。换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同 参考文献的选择吧。不过没有参考的话 一般DDM是优先选择的。尤其对于a-helix膜蛋白。
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问
为什么有的时候跑不出条带,然后背景还很糊?
迟C迟
背景模糊可能有以下几个原因:1. 没有封闭好,可能很大2. 一抗浓度太高,适当降低增加一抗稀释比例,你最好先做个titration,确定一个最佳的抗体稀释比例3. 二抗孵育时间太长,一般室温45min,二抗切不可孵育时间太长没有目的条带是主要问题,检查样品蛋白和抗体。
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问
请教一下,准备做coIP,抗体选择原则是什么?
迟C迟
直接登陆Thermo Fisher Scientific 官网的抗体主页:www.thermofisher.com/antibodies ,选择具体的实验应用(Application),例如WB/IF/IHC/ICC/ELISA/FACS等Tip:不同的实验对抗体的要求是不同的,一种抗体也有可能适用于多种用途。例如适用于Western Blot(WB)的抗体多数也适用于Dot blot、免疫组化(
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问
怎么保存可以延长一抗的使用时间?
dxywode
工作液根据需要稀释在5%奶粉里,再加入少量叠氮化钠(大约0.01% w/v),4度保存。Alisa_lin(站内联系TA)分装,-20度保存。不要反复冻融,没有用过粉末的二抗,按说明书呗石头2011(站内联系TA)液体的一抗没加甘油的话尽量不要放在负二十,因为用的时候反复冻融不好。粉末状的二抗负二十就行了sayaya(站内联系TA)液体的一抗直接放-80度贮藏,可保存5年以上;液体的一抗加50%甘
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问
在做聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳时经常出现图中条带弯曲情况,影响文章质量,如果改变这种情况,怎么才可以让条带变直
生物小硕硕
可以在电泳加样之前空泳道电泳一会,使离子平衡
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问
WB显示培养基中的外分泌蛋白大于胞内的,这种结果正常吗,蛋白分泌到胞外大小会发生改变吗
bamboopiggy
蛋白分泌出胞外,一般会变小,因为要经过剪切。你是跑的native的胶还是denature的胶?会不会是你的分泌蛋白形成了高级结果?
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问
蛋白经凝胶过滤层析后,杂蛋白(与目的蛋白相差30kDa )不能分离开,有改善办法吗?
天一湖医者
分不开一般可以选择其他的层析手段分离,比如离子交换或者疏水
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问
目前国内蛋白质阵列技术有什么发展前景
迟C迟
蛋白质微阵列亦被称为蛋白质芯片,可以实现对生物蛋白分子准确、快速、大信息量的检测, 是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术. 简单地说, 就是一次试验中同时检测几百甚至几千种目标蛋白/多肽的分析技术。
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428 围观
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问
大分子WB的信号如何跑好?
邓豆豆逗
可以配置8%的分离胶跑,转膜可以考虑300mA恒流40min 做好降温,同时可以提高上样量和抗体浓度
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1743 围观
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问
蛋白加Loading煮了以后变色会影响实验吗?
bqejjh123
你的样品有什么特别的成分,一般Loading加进去变红是因为样品太酸,加入2ul氢氧化钠即可,如果样品沉不下去,适当加些甘油增加密度。
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问
提取的核蛋白wb条带多条带怎么办?
邓豆豆逗
提取的核蛋白可以做一下GAPDH看看,如果能检测到条带,说明提取的核蛋白不纯,存在胞质蛋白的污染,可以考虑碧云天的核质分离试剂盒
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问
菌体破碎后用包涵体溶解液溶解后需要用0.45nm 的滤器过滤,但是总是堵住滤器,没有办法过滤,咋办呢?
迟C迟
可以用超声再次破碎一下菌体,裂解更充分。再者可以先离心裂解液,再用过滤器过滤。
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问
本人最近在做蛋白表达,蛋白表达在包涵体,用的是8M尿素进行溶解,但是溶解的总是不完全!这是为什么呢?
lyang556
可以尝一下以下方法:1. 提高pH值,比如pH10或以上;2. 添加高浓度还原剂如DTT等;3. 提高溶解的温度;4. 借助其他物理方法如超声波等。
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问
请问怎么高效地提取膜蛋白?
dxywode
使用离心管柱分离技术起始材料仅需 undefined107 个细胞,即可将细胞 / 组织分离为细胞浆,细胞核,细胞器和质膜组分。 离心管柱带有特定孔径和表面性质,当细胞通过离心管柱,细胞膜被破裂分离出完整的细胞核,随后通过差速离心和密度离心分离出质膜蛋白,无需使用超高速离心。
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427 围观
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问
求再做WB实验时,最后跑出来两条清晰的条带,可能的原因有哪些呢?
未来9
有可能是同一个蛋白的磷酸化与为磷酸化的形式,分子量很接近!或者是甲基化等等!
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980 围观
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问
我的条带很浅显不出来怎么办?分子量也不小大约26kda
dxywode
转膜条件是否合适,先需要确定蛋白成功转至膜上一抗和二抗的比例,是经过尝试的么,有没有提前在ELISA上验证反应性。曝光显色试剂是否失效,尽量使用新鲜有效的。
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193 围观
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问
在显色设备支持的情况下,荧光显色和化学发光显色,如何选择?
迟C迟
关注这么几点就好了,灵敏度要高,稳定性要好,背景要低,成本最好越低越好,几种方法各有优缺点。现在化学发光显色试剂盒ECL灵敏度最高的能够达到飞克级别了,不仅灵敏度要高,检测范围也要广,我们前段时间试了炎熙的极敏型试剂盒,灵敏度很高,也有其他灵敏度的可以选择,例如增强型,超敏型,稳定性都很好。
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523 围观
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