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科研学霸天团,48小时有问必答
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做wb的时候内参条带不齐,
未来9
单独上样可以出现,可以排除蛋白本身的问题,但混合一起加时却跑的不齐,最大的可能就是胶的问题,胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。再就是抗体孵育问题,不知你是用孵育盒,还是用封膜孵育,一定要保证膜与抗体充分接触,保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的,注意混合比例
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问
为什么同一张膜电泳后裁开敷不同的抗体,曝光后的条带有的背景很高,有的背景很干净?
府宅
可能是你敷抗体的时候敷的不均匀。
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问
凯式定氮法与双缩脲法测定时的异同。
dxy_gwrp7ndq
双缩脲法有重复性、线性关系好的优点,有灵敏度低、测定范围窄、样品需要量大等不足。凯氏定氮法进行蛋白质检测的,测定范围在0.1mgN~200mgN(毫克氮)(含氮量0.02% ~ 95%),需要的样品量也不像双缩脲法的那么大,只需要几克就行,因此,能够满足样品量不那么丰富的物质测定。
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问
加入乙醇洗涤能吹散沉淀吗?是吹散让它更纯还是会影响下一步操作?
天一湖医者
将一定量的乙醇加入之后,能够通过离心回收所有形成的核酸沉淀,并不能吹散沉淀。
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问
提酵母菌和提细菌的RNA有什么区别吗?分别有什么注意事项?
bamboopiggy
酵母菌因为rna含量较多,dna含量少,所以一般用稀减法提取,细菌的一般和细胞一样,用酚氯仿抽提就可以了。
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问
取材的时候没有液氮用干冰代替可以吗?
迟C迟
可以的,只要能冻住。很多生物公司运送样品也是用干冰,但是干冰的效果没有液氮好。
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问
如何有效控制内源酶的活性呢?
迟C迟
方法有很多。比如如果是提取RNA,可以通过低温。如果是提蛋白,可以加入蛋白酶抑制剂等等,这些实验步骤都很成熟了。
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问
枪头必须使用无酶的枪头,若只有普通枪头怎么处理呢?
迟C迟
要用DEPC水泡2天,再报上报纸,高压灭菌,就可以用作RNA实验了。
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问
一个基因有3个转录本,应该选取哪个反转录呢?
天一湖医者
1、带有MANE Select transcript标签,说明在ensemble和NCBI数据库中均认定该转录组是最主要,最保守和最高表达的。选择该转录本即可2、如无MANE标签,可看 APPRIS,它是相似的评价标准,P1代表最主要最相关的转录本。3、如无以上标签,可看注释,CCDS显示转录本的编码序列,与ensemble和NCBI数据库相匹配。
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问
RT过程以相同效率反转录rna,是什么意思?怎么实际操作呢?
天一湖医者
RT过程应以相同效率反转录RNA,否则会影响qPCR的启动效率,进而带来不同的实验结果,因此对于每个RT反应应使用相同的条件。如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时,可选择两步RT-PCR。另外,当RNA的存储是个问题时,最好是进行两步RT-PCR,因为cDNA在-20℃是稳定的。
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问
检测RNA病毒,使用一步法还是两步法?
天一湖医者
一步法优点: 只需一步,反应发生在单管中,速度比两步法更快,而且需要较少的准备和操作时间。处理大量样品时易于操作,减少污染的机会。整个cDNA样品都被扩增,灵敏度更高。缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性,因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。 两步法 优点: 可以分析同一样本的多个目标。逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA,可以储存cDNA用于后续实验,检
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问
WB实验条带异常问题?
vae1476
这种一般是胶不均匀的问题,等下层凝住了再加上层,会好一些
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问
请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开?(当然修饰后还残留有聚乙二醇,这个小分子也要除掉)
崔果儿
大多用凝胶过滤,这也不错的做法,毕竟PEG是链状的分子,在柱子上和普通蛋白行为不一样,修饰度越高那么出峰也越后,因此蛋白选择sephadex G50试试,它的范围在1000-30000,应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链,修饰后的蛋白疏水性增强,修饰度越高,疏水性越强,可以用这个原理分离。离子交换也可以选择,因为同样道理,修饰度越高,电荷被屏蔽也越多,电荷也越少,因此应该修饰度越高越先出。
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问
超滤技术的关键是膜,膜都有哪些分类,各自的特点适合的实验是哪些?
天一湖医者
超滤膜的分类有很多:按照膜组件的不同分类:有管式超滤膜,板框式超滤膜,卷式超滤膜和中空纤维式超滤膜。按照按照压力驱动形式的不同:可以分为外压式和外压式。膜材料的不同分类:有有机超滤膜和无机超滤膜两种。
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问
包涵体沉淀(σ32)的溶解、重折叠和离子交换层析实验时
迟C迟
每 4 h取 150 ul 样品,用反相高效液相层析 (HPLC) 测定去垢剂含量,这样可以确定透析去除 SKL 需要多长时间和加到离子交换柱的样品中有多少去垢剂存在。
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问
蛋白质印迹免疫分析时,蛋白质如何转膜?
bamboopiggy
三明治夹心法,将滤纸 胶 膜 滤纸,制成三明治夹心的方式,然后分干转和湿转,看你的仪器。
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问
WB条带大小和预期差别大,变性后的样品大蛋白降解快怎么办呢?
天一湖医者
确定蛋白是内源的还是外源的,如果是外源蛋白是不是全长序列SWISSPROT 数据库查询该蛋白是否有其他 isoform; SWISSPROT 和文献查询蛋白质是否有剪切活化,剪切活化造成蛋白变小; 确定蛋白质是否是二聚体或多聚体。 NCBI 和 SWISSPROT 查询蛋白质表达后是否有修饰,如有修饰会导致蛋白质增大;
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问
转膜夹受力不均匀怎么办?
dxy_gdng8xm6
朋友,请问你解决这个问题了吗?
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问
做WB中裂解液与细胞的比例?
bamboopiggy
6孔板长满,大概用100-200ul收,就可以测浓度。组织的话,一般是1mg:100ul就可以。脑组织的话1:50更好
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问
小分子蛋白的WB要怎样跑?
天一湖医者
跑胶时注意观察溴芬兰前沿,小分子不要跑太久,前沿接近胶底部就可以了。另外跑完胶染一下胶,看看你marker的11kd那条带在什么位置
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