实验问答21,939,037 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问WB扫出来的图第一次有气泡，再扫一遍会有影响吗？

Lv花开花落

没影响，静置一会儿能用。就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。

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问在点样的时候先加样品还是先加显色剂？需要考虑反应起始时间相同的问题吗？

dxy_gwrp7ndq

当然是要先稀释样品，再加显色剂，否则一会造成显色剂的稀释，有误差，

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问请问一下，SDS-PAGE蛋白质电泳，最近跑出来的胶都是这样的，以前不会，更换了配胶的母液，Buffer，还是一样，有哪位大神知

Lv花开花落

胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大TEMED和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。胶不凝，解决方法：温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法：首先

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问一张膜曝光之后，用那种膜洗脱液效果比较好，洗多久合适？

府宅

TBS/T洗膜3次,每次5分钟。用滤纸去尽残液

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问wb显色出来背景黑，条带不明显，而且跑出来带歪歪斜斜，这是咋回事呀？

迟C迟

1.牛奶或封闭用BSA产生的非特异性结合，引起背景。这在使用种属来源于山羊（goat）的一抗时常有发生，因为山羊来源的蛋白与牛来源的蛋白具有较高的同源性，抗山羊二抗容易与牛奶/BSA特异性结合产生背景；此种情况下，一般推荐用驴血清封闭；笔者经验是如无驴血清，仍可用牛奶封闭，只不过笔者会提前一天用牛奶配制二抗，提前让二抗与牛奶进行非特异结合，并回收二抗、重复使用，笔者的这种方法做出来的条带背景与朋友

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问为什么疏水性差异的两种蛋白在反相层析和疏水层析上，出峰位置相反呀？

Lv花开花落

1、一种是疏水性太强，这样的蛋白质有非常强的疏水相互作用，往往容易导致结合上疏水层析后难以被洗脱下来。需要极其剧烈的洗脱条件，可是剧烈的条件由容易造成蛋白变性。所以不适合采用疏水层析。2、另一种就是疏水性太弱，这样的蛋白质亲水性强，疏水性弱，往往加入一点盐后就容易发生盐析作用。难以稳定的存在于高盐的流动相中，也就不适合采用疏水层析。

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问WB各组间内参的条带差异较大，可能的原因是什么，如何避免。

府宅

WB最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是您敷抗体的时候敷的不均匀。建议您在仔细的做几遍也可能是在显影液环节，简单来说就是您的膜没有淋干净，上面残留参差不齐的 T/TBS，T/TBS 能稀释显影液，目的条带本来表达量就少，某一个点残留的 T/TBS 稍微多一点就可能导致显影效果下降，所以建议在显影液反应前，尽量将膜上的洗膜液淋掉

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问对于文献中特异性抗体，用到的并不多，都是买文献用到的那个公司吗？

dxy_gwrp7ndq

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问同一胶连续三个孔做重复不一样

我也是锦鲤ye

湿度、温度，实验过程操作的人工误差

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问为什么跑胶时那个样品条带跑的很宽？有人说是胶不好也有说电泳液时间长了，不知道原因？

未来9

有三种可能的原因。1.电泳缓冲液用的次数过多，一般来说电泳缓冲液用过两次以后电泳的效果就会变差。2.电泳的浓缩胶和分离胶缓冲液的PH没有调好或浓度没有调好。浓缩胶和分离胶胶浓度的变化和PH的变化让电泳样品压缩在一起。一般情况下浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tri s—HCl， pH8.8)。3.提取的粗蛋白样品里面有杂质，细胞里面除了含有蛋白质还有核酸、多糖、纤维素等

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问怎么通过氨基酸序列推测它在折叠后的空间结构域

bamboopiggy

网上有好多预测工具，你可以试试，尤其最近AI出现，更方便了。如alphafold2

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问如何更好地保存蛋白？

dxy_gwrp7ndq

纯化后的蛋白测浓度后，加入50%甘油，确认混匀后分装，液氮速冻，放入-20度或-80度保存，尤其适用于酶类。如即提即用的话，可将浓缩蛋白质储存在单一溶液（如PBS），置于聚丙烯管或干净的玻璃容器中，放在4°C冰箱保存。

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问怎么根据氨基酸序列来推测它折叠后的结构域。

dxy_gwrp7ndq

3D- pssm、Swiss － model （同源建模）可以预测

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问293T细胞外转泛素老是表达不齐怎么办？

府宅

防止细胞污染细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因

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问请问SDS-PAGE蛋白质样品上样后在高压下快速跑完和低压下慢速跑区别大吗？哪个更好？

dxy_vx1y73j9

低压条件下，条带相对均匀，位置更准确；高压条件下，由于加样量与样品浓度的差异，有可能导致条带不是一字型，或者跑斜；具体以自己样品与实验为准，多实验对比，如果高压和低压一样，那肯定高压，省时间。

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问wb的一抗该怎么选择，二抗是多个蛋白样品共用的吗

whilt-shirt

一抗一般选择兔来源的抗体，兔来源的抗体要稳定一些，二抗是根据一抗来定的，而且比较便宜，一般抗兔、抗小鼠都会备一点

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问WB实验怎么避免两个泳道的样品在显色的时候条带连在一起？

天一湖医者

1.上样量过大 ,一般上样在20-100ug之间就可以，上样的体积尽量小一点，10—20ul为宜。上样一定要迅速，点完后需立刻开始电泳，否则会引起样品扩散。样品中盐浓度高也可以引起。样品要充分混匀，煮沸变性。 2.一抗孵育时间过长，适当缩短孵育时间，通常4度过夜为宜。 3.一抗和二抗浓度过大，抗体如果很好用的话，增大稀释比例试试。 4.曝光时间过长，同样会由此现象。不同的时间多曝光几次。

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问请问特异性抗体常常出现不明的非目的条带是为什么呢？定量后的蛋白样为什么会出现有目的蛋白但无法敷育出内参的情况呢？

Kimser

非特异性条带可能是蛋白量较大，可以适当减少，也可能是蛋白不够新鲜，导致蛋白降解较多，可以更换新鲜蛋白。无法孵育的原因可能是孵育时间不够，考虑温度的原因可以适当延长孵育时间。

4 回答717 围观

问为什么有时候浓缩胶和分离胶之间有气泡，会影响实验结果吗？

丁香粉猪猪

先倒分离胶,然后加0.5ml水在分离胶上，等到分离胶凝了，再倒浓缩胶。这样不会起泡

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问想要筛选差异蛋白，怎么选择合适的技术呀？

丁香粉猪猪

可将经典学派的策略分为基于分布假设和基于传统非参数检验策略两类。（1）基于分布假设的统计策略基于分布假设策略的一般步骤可总结为：1）假设数据集服从某种特定的分布；2）建立统计模型、构造统计量；3）计算 p 值、确定阈值，比较得出结论。研究某蛋白质在两种状态下表达水平差异的显著性，相当于检验两组数据的均值是否存在差异。而 t 检验是统计方法中发展较成熟的、用于分析两组样本间均值差异的方法，t 检

5 回答476 围观

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