wb显色出来背景黑，条带不明显，而且跑出来带歪歪斜斜，这是咋回事呀？

1.牛奶或封闭用BSA产生的非特异性结合，引起背景。这在使用种属来源于山羊（goat）的一抗时常有发生，因为山羊来源的蛋白与牛来源的蛋白具有较高的同源性，抗山羊二抗容易与牛奶/BSA特异性结合产生背景；此种情况下，一般推荐用驴血清封闭；笔者经验是如无驴血清，仍可用牛奶封闭，只不过笔者会提前一天用牛奶配制二抗，提前让二抗与牛奶进行非特异结合，并回收二抗、重复使用，笔者的这种方法做出来的条带背景与朋友使用驴血清的背景相当。

2.抗体回收、重复利用：抗体纯化后，或多或少遗留动物来源的非特异性免疫球蛋白，这些免疫球蛋白可能与膜或者封闭液产生非特异性结合，产生背景，在初次使用时背景偏重，随着抗体回收、重复利用的次数越多，背景会越来越淡，在此特别推荐抗体回收（因笔者见老板和隔壁实验室的同学从不回收抗体，他们担心回收抗体影响结果）；在初次使用时，亦可通过延长PBST漂洗时间来降低背景，笔者曾过夜漂洗过NC膜，背景显著降低，同时并不影响WB的特异性条带。

背景黑，条带不明显是抗体不太好使。条带歪斜是灌胶不匀。

背景黑有可能是转膜没转好，条带歪歪斜斜可能是电泳问题

1.一抗浓度太高，用个两三次就好了；抗体不好2.封闭不完全，时间不够3.洗脱时间次数不够。

可能的原因及建议：

①膜封闭不够，建议延长封闭的时间；选择合适的封闭液。

②一抗稀释度不适宜，太高，选择最适宜的抗体稀释度。

③ 一抗孵育的温度偏高，建议4℃过夜孵育。

④选择的膜容易产生高背景，一般NC膜的背景会比PVDF膜低，但是NC膜吸附力也就差了一点。

⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过，实验过程中要注意保持膜的湿润，使用镊子夹取膜。

⑥检测时曝光时间过长，可减少曝光时间。