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western抗体孵育时间
实验菜狗lmd
一抗孵育时间和抗体浓度有关,如果是首次使用的抗体,过夜四度(12-16 h )都可以,如果孵育时间过长会导致背景比较深
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问
实验过程中,切片边缘总是着色,怎么避免呢?
Eason老歌迷
你的试剂有没有充分覆盖标本组织?超出组织边缘2mm试一试
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问
蛋白质变性后,怎么样操作才可以尽可能的延长其保存期?
Eason老歌迷
一,切记蛋白质的储存标准:超低温、分装、浓缩、冷冻/速融、添加剂。二,如即提即用的话,可将浓缩蛋白质存储在单一溶液(如PBS),放置聚丙烯管或整洁的玻璃容器中,放到4°C冰箱储存。分析到适合的缓冲溶液中能够冻干,放4°储存;也能加浓度较高的的硫酸铵(你的蛋白质不沉积的话),4°储存。提纯后的蛋白质测浓度值后,添加50%凡士林,确定搅拌后分装,液态氮冷冻,放进-20度或-80度储存,特别是在适用抗氧
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问
怎么样更大程度上减少非特异性荧光染色?
Eason老歌迷
缩短一下一抗二抗孵化时间来看看?
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问
提高蛋白质纯化的成功率有什么好的经验分享?
一个小哭包
蛋白质纯化工艺中的其他因素也会对蛋白质的稳定性产生影响。对蛋白质的处理步骤越少越好,在最短时间内采用最少步骤的纯化工艺才能保证得到最高产率的活性蛋白质。而且,在整个纯化过程中,蛋白质最好都保持在低温状态。一般纯化过程都在4°C进行,因为这个温度既可以降低酶解速度(在含有蛋白酶的情况下),又可以保证蛋白质的结构完整性。
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1108 围观
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问
怎样增加蛋白样品的稳定性?
雨婷42B1
尽量减少保存蛋白的反复冻溶,可以将提取的蛋白少量分装于离心管,用时取出即可。
4 回答
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问
细胞水平要做 Western Blot,一般需要多少量细胞提取的蛋白就够了?
实验菜狗lmd
主要和你的细胞大小,蛋白表达情况有关,细胞比较大,或者蛋白属于微量蛋白,那最好三个孔(6孔板)
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问
如果目标蛋白是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂应如何调整?
Eason老歌迷
最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
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问
蛋白变性后,如何可以提高保存时间?
书香雪峰
蛋白质可以保存在-20度或-80度中,避免反复冻融
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3694 围观
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问
脱脂奶粉中含生物素,如果实验中有涉及到“生物素”时需要注意什么?
bamboopiggy
脱脂奶粉中含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留,在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时,也会产生高背景或使得本底水平增高。
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问
一抗,二抗的比例是比较重要,怎样调整好一抗,二抗的比例?有没有经验分享一下,谢谢
bamboopiggy
一般,拿到一抗就先1:1000 试一下,如果浅就改1:500.如果深,就改1:2000,基本差不多,二抗,问卖给你的公司,他们一般有个参考值,有的1:4000,有的1:1-2万。
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1269 围观
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问
抗体工作溶液可以储存反复使用吗?
bamboopiggy
看你用的频率,如果每天都用,至少可以反复用三次,如果不是每次都用,可能一周左右还是可以再用的。
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756 围观
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问
转膜液加甲醇的目的是什么?
bamboopiggy
甲醇加到转移缓冲液中主要有两种作用:1.稳定凝胶的大小,2.除去与蛋白质分子复合的SDS.
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4988 围观
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问
电泳时 Marker 总跑不全所有条带,即使用增大胶浓度仍不全?
bamboopiggy
一般用10-180kd的marker,在10%的胶上是可以跑全的,看你的实验目的,不行可以买预制胶,有梯度胶,显示所有的marker在10180之间。
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问
WB结果用imagej统计灰度值时降背景是必须的吗?
Eason老歌迷
正常的流程,是必须要降背景的。你要是想不弄,你可以试一试先,看看得出的结果可不可行。
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575 围观
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问
肽段进质谱主要断的是什么键,形成哪些碎片离子?
Eason老歌迷
肽段在质谱中的碎裂有一定的规律,肽段母离子在质谱仪的碰撞室经高流速惰性气体碰撞解离,肽链在酰胺键出断裂并形成子离子,差生a、b、c型和x、y、z型系列离子。a、b、c型离子保留肽链N端,电荷留在C端;x、y、z型离子离子保留肽链C端,电荷留在离子N端。其中b型和y型离子离子在质谱图中较多见,丰度较高。y、b系列相邻离子的质量差,即为氨基酸残基质量,根据完整或互补的b、y系列离子可推算出氨基酸序列。
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问
用50mMHEPES,含4%SDS的裂解液裂解细胞得到的是细胞表面蛋白质吗
Eason老歌迷
总蛋白。得到的蛋白可以用来电泳,
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245 围观
3 回答
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问
如何提取细胞表面蛋白质呢?
bamboopiggy
去买一个试剂盒,可以直接提,可以去thermo的官网看看,好多可以用的试剂盒,便宜的碧云天有。
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1176 围观
3 回答
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问
犬埃立克体virb9基因的表达
Eason老歌迷
是不是,实验中某个步骤没有做好呢?回顾检查一下。
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261 围观
3 回答
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问
关于APSite问题?
Eason老歌迷
两者原理并不一样。对ssdna并无作用。不能。
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418 围观
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