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科研学霸天团,48小时有问必答
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WB的上样质量一般是多少
Gx41
30-60ug,根据目标蛋白量调节
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问
wb总是两边泳道条带颜色浅。
Eason老歌迷
可能是转膜的时候夹子没夹紧,导致两边转膜不完全。
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问
求助大佬,跑肝组织stat6总蛋白和磷酸化蛋白趋势相反,这能解释的通吗?
bamboopiggy
有的时候,总蛋白会和磷酸化的蛋白变化趋势是一致的,看你的结果,可以总结为模型使stat6的磷酸化下降,而加药后,会抑制总的stat6的蛋白,但是会使磷酸化增高。来rescue
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真核蛋白分泌表达
冷泉港蛋白
没有这样的载体。蛋白是否能分泌出来取决于1.蛋白本身的高级结构 2.是否含有信号肽
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问
求助|大家是怎么提组织样的总蛋白的?
bamboopiggy
1.你取了中肠以后,先用pbs洗一下,然后直接放入lysis(+cocktail)中,研磨,研磨过程中全程冰上放置。研磨完以后,冰上放置5-10min,然后再离心,然后再加上样buffer煮。2,如果还是做不出来,可以考虑用液氮快速快速冰冻,然后用研钵研磨,然后加入lysis,冰上放置5-10min,然后再离心,然后再加上样buffer煮。
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问
怎么查询目的蛋白是不是磷酸化的呢?
冷泉港蛋白
UniProt上翻译后修饰可以看到是否磷酸化
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问
酵母单杂交
Eason老歌迷
转化后如果是过夜就取出来的平板,菌落可能不会长得很大。主要还是要看放置一段时间后,菌落形态是否有变化(可以在37C继续培养,如果怕长过了,也可以放在室温下)。如果还是保持原来的状态,或者长出来更多的小菌落,则很有可能是污染。如果菌落明显在生长,而且透明度也变化了,应该是正常生长。另外,如果这一批菌生长速度明显低于平常,需要考虑是不是抗性加高了,或者IPTG加高了,抑制了菌的生长。最后如果形态与平常
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如何判断eLisa和高效液相对血药浓度的精准??
大草原的小灰驴
首先需要做倍比稀释的预实验,判断药物浓度与ELISA反应后的吸光度OD值是否呈线性关系,并做出拟合曲线,对其方程公式做相关系数等常量的假设检验。
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问
WB曝光显示too faint到底是怎么回事?
Eason老歌迷
too faint!意思是你的条带太淡了,设备显示不出来。你转完膜用丽春红染一下,看看有没有条带。
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问
跑的WB为什么目的蛋白时高时低或者没有趋势呢?挺让人头疼的结果
Eason老歌迷
可能和你上样量不稳定有关,你提完蛋白测一下浓度,按照浓度算上样体积。或者是你转膜没转好。
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问
请问最后胶片显影的时间多长合适,怎么判断呢,老是掌握不来时间,感觉胶片放在显影液里面一分钟后会颜色会变深,但是条带还没有出来😔
balalaLy
时间不好把握的时候可以同时叠加多张胶片,总能得到一张比较合适的片子
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免疫共沉淀的图怎么看啊
冷泉港蛋白
一、免疫共沉淀的机理:1. 首先证细胞内存在这两个蛋白2. 阳性表明可能存在互作(实验组)3. 排除非特异吸附(对照组): 蛋白a b没有非特异吸附到磁珠和抗体的恒定区 二、免疫共沉淀研究的几个层次1. 蛋白a和蛋白b是否存在互作(图上)2. 二者的关系,进行过表达(图下Flag)或抑制表达相关实验3. 是直接互作还是间接互作
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求助:制备了一个纯化柱,请问DBC怎么计算
Eason老歌迷
要用蛋白的纯品。C0是指穿透X%时收集的穿透样品的浓度。
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问
新手小白WB条带分析不懂,求大佬指点
求求不要翻车啦
第二张图有小黑点,问题出现在奶粉没溶好。条带不清晰,或没有,跑电泳,染胶,如果条带清晰,说明是转膜的问题,蛋白都没转过去,可能是你夹三明治的问题。如果条带不清晰,说明你的样品有问题。
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求助大佬:DSS诱导的结肠炎C57BL/6J小鼠,想要用流氏细胞术检测其Th1/Th2/Th17/Treg
Eason老歌迷
不可以用脾脏代替血液来做流氏。小鼠做淋巴细胞分群必须经过刺激培养。 2022-07-25
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问
小鼠脑组织切片
丁香一方
固定,取材当天即把所需包埋的组织取出后放入4%的多聚甲醛中(12h);冲水,12小时(注意水流不需要太大,不可将水流直接冲击组织)脱水,60%酒精 4h(或者 60%酒精 4℃12h)→70%酒精 4h→80%酒精 4h→90%酒精 4h→95%酒精4℃12小时→100%酒精Ⅰ2h→100%酒精Ⅱ 2h→100%酒精III 2h透明,二甲苯Ⅰ5+3 min→二甲苯Ⅱ5+3 min→二甲苯Ⅲ5+3
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TUNEL荧光染色
balalaLy
尽量不要长时间高强度曝光,会导致荧光萃灭。
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问
如果提取蛋白的浓度较低,有没有什么办法可以浓缩下?
whilt-shirt
可以使用透析法浓缩蛋白,也可以增加上样量
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western blot,请问电泳的时候总是有这些尾巴是为什么
Eason老歌迷
细胞样本的话是残存血清的原因,其次是制胶的原因,另外上样过多或者上样时候吸取的不全是上清也会造成。
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新手小白做WB,目的条带不清楚,还有趋势不对怎么回事?求帮忙
Eason老歌迷
能看到模模糊糊好几个条带,背景比较脏,建议你可以封闭时间稍微延长,然后你的抗体特异性不高,可以换一个特异性高的试试。
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