实验问答22,819,514 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问一抗用鼠抗还是兔抗？

Eason老歌迷

一般我们都不裁膜了，可以按照你的这样做法来做，我觉得可行。

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问IP实验

转云511

说明你的目的蛋白在野生型的细胞里也有表达，但是表达量很低。过表达的细胞里，目的蛋白表达量多。IP后，可以看到很明显的，过表达的蛋白条带要比野生型的条带粗的多。野生型在这里可作为对照，一个目地是看你的方法对不对，方法对的话，野生型是有条带的，要是没条带，说明IP的步骤有问题；另外一个目地是看，你的过表达细胞是不是目的蛋白真的过表达了，从条带的粗细可以看出来。

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问第一张WB条带为什么会这样子？有没有大佬解决一下

Eason老歌迷

下面图的条带还行了。上面图这个看着像是上样量太大了，或者是你选的抗体特异性不高。

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问测蛋白浓度时BCA标准品未稀释怎么办？

balalaLy

标曲是不影响的，但可以会影响你的蛋白浓度值的准确度，如果你的样品蛋白浓度很低，超出了标曲的范围，就会不准。

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问ip实验

Eason老歌迷

野生型细胞和过表达细胞系做的IP实验下拉下来的蛋白也不一样，会有差异的，建议你看看文献作参考。

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问wb电泳问题！求助

Eason老歌迷

有几个原因，一个是你的电泳液使用了几次更换。一个是你配胶混匀了吗？一个是你的电泳条件是不是设置的正确。一个是你的buffer换了吗？

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问cleaved-caspase1的western blot

balalaLy

cleaved-caspase1不好做，它的表达量低且容易降解，可以尝试做一个时间梯度

3 回答1867 围观

问Raw诱导破骨细胞

丁香一方

图片不错，恭喜您，您诱导成功了

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问不懂就问，为啥上样会出现这种情况?以前上样没遇到过

麻黄连翘赤小豆

上样量太大造成的拖尾电泳跑太快缓冲液用太久可以调整新的看看蛋白降解

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问WB中浓缩胶的量一般是多少，蛋白跑出浓缩胶后没有浓缩成一条线，而是拖的很严重是为什么，该如何解决

府宅

拖尾原因：1.上样量不均，从内参就能看出，建议检测总蛋白浓度后调节至相同用量如50ug；2.可能与蛋白变性、凝胶质量、电泳条件、封闭条件、抗体特异性有关，建议调至相同浓度后变性，可进行80、120v电泳，室温封闭2-3h，降低一抗浓度（增加稀释倍数），可降低所用蛋白总量。

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问做elisa发现大部分样本od值均小于空白孔od值是怎么回事呀，做过两次，换了样本，且步骤是按照说明书做的

whilt-shirt

有可能是样本出问题了，建议重新提取样本

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问泛素化，泛素分子与靶蛋白什么位置结合？

你好几和户

泛素添加到靶蛋白cyclin E和β-Catenin泛素化的过程进行研究，这两种靶蛋白能够控制细胞的周期。泛素活化酶E1激活泛素并将其转移到泛素交联酶E2上，随后泛素连接酶E3识别特定的需要被泛素化的靶蛋白，并将泛素从E2上转移到靶蛋白上。

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问【求助】MEK1/2的磷酸化位点

bamboopiggy

应该是不一样的，这两个位点都能查到对应的抗体，所以应该是不一样的。

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问求助WB内参不齐

whilt-shirt

可以用image j计算灰度值后调整上样量，缺的部分用2x的loding buffer补足

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问蛋白提取问题细胞蛋白提取

冷泉港蛋白

正确做法：加入上样缓冲液，煮十分钟，分装，尽早跑WB,暂时不用的放于-80度冰箱。为什么这样做：1.煮的作用：可以破坏蛋白的疏水和氢键，破坏高级结构，使蛋白变性。2.上样缓冲液的作用：含有还原剂和SDS，还原剂破坏了二硫键，SDS破坏疏水，从而实现变性蛋白的目的。3.低温的作用：降低温度是为了减缓分子运动，降低碰撞，减缓目的蛋白的降解，因此温度越低越好！4.负80度，还存在分子运动，所以应该先变性

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问免疫共沉淀—磁珠成团啦，咋整？

Eason老歌迷

可以重悬试一试。倘若磁珠形成团聚，导致磁珠的表面没有完全暴露出来。如果该问题出现在早期的生产步骤中，则会导致涂层的不均匀；如果发生在后期，就会导致试剂反应性有较大的差异。

4 回答3927 围观

问用抗原诱导机体产生不同用途抗体时，对相应抗原有什么要求？

冷泉港蛋白

一、我想总体的原则应该是：1.抗原（免疫原）应尽可能的与检测对象的构象保持一致！2.纯度当然越高越好了，起码要达到80%二、对抗原的要求（根据抗体用途进行分类）：1.wb用途，我们检测的是变性的抗原。免疫原也最好是变性的，很多情况下我们拿不到足够多检测对象去做免疫原，就得考虑基因工程了，当然还涉及到表达系统的问题。最好能沟保持一致2.IHC用途，经过多聚甲醛固定之后的抗原，介于天然与线性之间了。考

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问第一步孵育时间多了半小时怎么办？

whilt-shirt

可能后面背景比较深，多洗几遍试试

5 回答336 围观

问做Elisa时候用的是肝脏组织，因为肝脏富含蛋白，弄了很少一部分，但在检测吸光度时还是数值超标直接横线没测出来，怎么办

whilt-shirt

这种情况可以再稀释一下，降低浓度

3 回答182 围观

问IP实验中，为什么会结合出很多杂带

dxy_gwrp7ndq

可以通过更改NaCL的浓度以及去垢剂的比例，比如：针对单纯的IP或co-ip实验或者虽然是进行IP实验，但蛋白质之间的结合比较牢靠，可以考虑使用低浓度（0.2-0.5%）的SDS洗涤抗体-sepharose beads复合物，这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。

3 回答125 围观

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