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科研学霸天团，48小时有问必答

问怎样减少值 RNA 酶污染的机会？

dxy_gwrp7ndq

必须确保与纯化的rna接触的每一样东西都是无rnase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如rnase喷雾清除剂处理过，去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的rnase污染，可以用rnasafe。必须保证一直使用无rnase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。

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问miRNA相关试验如何开展呢？

dxywode

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问如何通过数据库查找RNA的结合蛋白

迟C迟

RBPDB（http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/）是RNA结合实验的数据库，包括人、小鼠、蝇和蠕虫4类物种，总共包含272个RBPs的结合数据，包括71个具有位置权重矩阵格式的基序的结合数据，以及36组免疫沉淀实验获得的体内结合转录本序列。

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问RNA逆转录应该在哪个区？

闭门羹牛

在扩增区，同时避免发生交叉污染

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问RNA干扰后，荧光强度可以直接表征转染效率吗

迟C迟

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问死细胞对rna提取有影响吗

whilt-shirt

死细胞影响不大，在提RNA过程中主要还是看活细胞

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问为什么提取RNA的时候一定要分层？如果不用分层就能提取出RNA，这样在吸取含有RNA的水相时就不怕污染了。

whilt-shirt

提RNA过程中分层是因为加入氯仿，氯仿会从trizol中萃取RNA，在吸上层的时候可以考虑不完全吸掉。如果经费充足的话可以考虑柱法提RNA，这种方法污染小。

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问使用同一种trizol试剂盒提取RNA，条件也一致，但产量总是不稳定。是因为每次加试剂量有差异，导致离心时没有甩干的缘故吗？

vae1476

你的样本每次是否一样呢，如果需要排除一下条件，可以每次加入一个质控样本，进行对照

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问如何高效的向原代细胞转染SiRNA？转染试剂？转染时间？

bqejjh123

　选择合适的siRNA转染试剂是的RNAi实验成功另一个关键。由于细胞毒性对siRNA实验有很大影响，它直接影响实验的结论和结果，因此必须选择低毒性转染试剂，以观察转染试剂的毒性是否较低。有一个简单的方法，看转染的过程和要求，比如要求的细胞密度越大，说明毒性越大，

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问如何提高纯度，试剂盒过柱提取结果不太理想

whilt-shirt

加洗涤液多洗几遍，多过几次柱子试试。

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问RNA干扰技术有什么缺点

上海欧易

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型，是进行分子机制实验中最常用的实验技术。目前，RNA干扰方式主要集中在两方面：化学合成的siRNAs和Vector-based shRNA。对于siRNA，其通常直接使用化学合成并转染细胞，缺点是稳定性较低，作用时间也较短；对于shRNA，其有

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问请问为沉默效果较好，si-RNA应在细胞汇合度多少时添加为宜？

迟C迟

提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度（Confluence）在30％左右为宜。

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问怎样保证细胞裂解充分从而保证全部DNA被提解出来

bqejjh123

建议可以用热休克法和超声波处理法

3 回答580 围观

问如何进行RNA的定量?

上海欧易

RNA定量最常用的方法是紫外分光光度计法，原理是核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可计算出其中RNA或DNA的含量。将样品的吸光度乘以稀释倍数乘以40μgRNA / mL，基于公式可以进行目标样品的浓度的计算。当然，目前市面上的一些基于分光光度计法的核酸定量仪器（如Nanodrop）已经不需要我们自行基于

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问如何提高RNA得率?

府宅

1.避免RNA酶污染：微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。2.健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。3.针对RNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转

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问RNA干扰技术可以用在哪些领域？

小布丁瑶瑶

RNA干扰技术可以用于包括鉴定基因功能、疾病治疗、植物病毒抗性研究在内的多项研究领域。

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问通过对引物进行预处理，但仍然存在异常(还是有杂质)，应该怎么办？

迟C迟

首先搞清楚是什么杂质？如果是不溶的杂质，可以通过离心沉淀等方法，上清的引物还能用。如果是溶解性杂质，建议重新订引物吧。

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问请问Trizol法提取RNA需要注意些什么？

dxy_gwrp7ndq

1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 ℃放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星

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问用DEPC溶解的时候促溶温度在什么范围与样品类型有关吗？

dxy_gwrp7ndq

与样品类型无关，一般在室温下溶解就可以了

3 回答410 围观

问RNAi 和PRISPR对比，哪个技术更好呢？

Kimser

个人认为后者更好一些。RNAi 是一种基因下调方法，但并不能完全去除基因的功能。而CRISPR是在引导 RNA 的指导下，与目的核酸片段进行靶向结合并进行切割。此外，尽管 RNAi 和 CRISPR 均存在脱靶问题，但由于CRISPR脱靶效率要远低于RNAi。

4 回答1873 围观

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