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        PCR扩增,长度符合预期,但是测序回来的序列经对比后,不符合要求。

        相关实验:巢式 PCR

        user-title

        dxy_p4luxqt9

        用高保真酶扩增目的片段,跑核酸胶观察条带大小,长度符合预期,切胶回收后连接载体,转化涂板,挑菌摇后,做菌液pcr,跑核酸胶观察条带长度符合预期,送测序回来结果对比,不是我要的目的片段。请问是哪里出了问题?(困扰我很久)

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        4 个回答

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        出现目的片段与预期不符的情况可能有以下几个可能原因:

        1. 污染或混合:在连接载体和转化涂板的过程中,可能存在外源性DNA的污染或混合,导致测序结果显示的不是您所期望的目的片段。这可能是由于工作台、试剂、PCR管或其他实验室环境中存在其他DNA片段的污染所致。为了避免这种情况,建议在实验室操作中严格控制污染,注意无菌操作,并避免试剂和操作工具的交叉污染。

        2. 扩增过程中的错误:在PCR扩增目的片段的过程中,可能发生了错误。这可能包括引物的选择不正确、温度梯度设置不合适、扩增时间过短或过长等。确保引物序列正确,并且扩增条件和时间适当,以获得准确的目的片段。

        3. 连接载体的问题:连接载体的过程中可能出现了错误,例如连接反应不完全、连接酶的活性不佳或连接条件不恰当等。确保连接载体的反应条件和酶的活性符合要求,并进行适当的控制实验来验证连接反应的效果。

        4. 测序错误:在测序过程中,可能出现了错误的测序结果。测序方法和设备可能存在技术问题或人为操作失误。在这种情况下,建议再次进行测序或与测序服务提供商联系,确保准确的测序结果。

        user-title

        科研小dog

        有帮助

        1.引物问题,可以blast排除一下其他扩增产物,如果结果没问题,提高退火温度试试,可以增加引物特异性。

        2.测序订单问题,核对一下选择的引物有没有包含想要测序的片段。

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        我也觉得是引物出现了问题,排查下引物吧

        user-title

        dxy_xextz7w2

        有帮助

        这个有可能是引物特异性不好,扩增出了其他形式的产物,导致连接的时候出现问题,造成结果错误

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