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        为什么我扩增的PCR产物达不到预期的长度

        丁香园论坛

        2792

        理论上应该扩增出超过2kb的片段,但每次得到的PCR产物都只有700多bp,跟这个基因的cDNA长度类似。换过好几个模板,得到的结果都相同。
        上游引物:CATGAGCTACATCAATCTGCCC
        下游引物:AGTCCAACCTGGGTAGGAG
        Genebank上查到的序列:小鼠胸苷激酶(tk)基因M68489
        1 ccatggcaga tccggaggga tggtcgagct ccaggctttt cacgtagctg agaggtggga
        61 cgagtcttgt cttcgtcccg cccccttttg agttcgcggg caaatgcgag cagtaagtcg
        121 aaatttttcc acccacggac tctcggtgct aactaaggtt tgcacagcag ccatgagcta
        181 catcaatctg cccaccgtgc tgcccagctc ccccagcaag actcgggggc agattcaggt
        241 gcggggtctg gagtggggtc gggtggtggc tggtgcgggg tgtacaaggg ggagacccct
        301 taaatgactt ctcttctagg tgattctcgg gcccatgttc tcagggaaaa ggtaatgaat
        361 gggccttcgg ggcggtgggc ctccctctct ctctgcagcc tctctctctg caggccctgg
        421 ctctcctctc ccccctcccc catcttccag gagcctctga ctaggcggca aacgcgctcg
        481 acctctgtgt gtacattccc gcccaaaatt cgatttcctg gattgctgcc atcctcctgc
        541 ccaagccttt tctcttgggg aaccctatct ttgctgaggc ggaccacatg ggggtacaat
        601 tgaagacccc agcccacatt acccaggagc cccaccgaac tctcatgtgt ccctgggagt
        661 taggcacctt ctctgacagt ttcctcattc attccccatg cgagctccta agctggagcc
        721 aattaactct gaggtgaggt ctaaactctg gagtcccacc cagaataaca ggctaccgac
        781 gctaggtggt agtggcagcc cgccttttgc tcgggcctca tgtgctctgg ttaattcttg
        841 cagcacagag ctgatgagaa gagtccggcg cttccagatc gcccagtaca agtgcctggt
        901 catcaagtat gccaaagaca cgcgctatag caacagcttc tccacacatg atcggtcagt
        961 cctacccctg agcctgccct tcggaaaccc ctaagcctcg ggggcacact gactgctagc
        1021 ctctagtgga tatgaataag tgctcaaaac tactagatac tgtccagtgt catgtaccac
        1081 gagctggaga ctgtcactgt agagctgcag attaggtgac actatagaat actcaagctt
        1141 ggtctctgcc cttgctcatt cttggccttc tcttcccagg aacaccatgg acgcattgcc
        1201 agcctgcatg ctccgcgatg tgacccagga ggccttgggt gtggccgtca ttggcatcga
        1261 tgaggggcag tttgtaagtc agcctgcagc ataacctcac cctgacccct gacccttcct
        1321 gccctgctga ctcagaagtc cctgtcatta acttgtcttt actggggtgc ggatccaatt
        1381 cgccctatag ctgagtcgat acaatcactg gcgtcgtttg catgctcagc tcccccacgg
        1441 tcttcgtcag gcccttgcct ggggcagata acctcatcct ctggactttt cccagtttcc
        1501 tgacattgtg gatttctgtg aaatgatggc caacgagggc aagacagtaa ttgtggcagc
        1561 gctggatggg accttccaga ggaaggtaag atgtctgact ctggcttggc acagtgcaga
        1621 ggcacagctc ctgacgttgc tctctggccc ccacacacat acacatgtga acacaggcag
        1681 aggagggagg tgcctggcta actgaccgca cacacctgct gctgtcttcc gtgcaggctt
        1741 tcggcagcat cttgaacctg gtgcccctgg cggagagtgt ggtgaagctc accgctgtgt
        1801 gcatggagtg cttccgagaa gctgcctaca cgaagaggct gggcctggag aaagaggtac
        1861 acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacaaca
        1921 cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacttact tctgcccaag gagtggggtg
        1981 ggcttaggct ctggcttctg agtcccaccc tcacatctcc ctcccaccag ggtgaggtga
        2041 ttgggcctgg agaaagaggt atacacacac acacacacac acacacacac ttctgcccaa
        2101 ggagtggggt gggcttaggc tccggcttct gagtcccgcc ctcacatctc cctcccacca
        2161 ggtggaggtg attggcggag ccgacaagta tcactccgtg tgccgcctgt gctactttaa
        2221 gaagtcttca gcccagactg ctggctcaga caacaagaac tgtctggtgc tggggcagcc
        2281 gggagaggcc ttggttgtca ggaagctctt tgcctctcag caagtcctac aatacaactc
        2341 tgccaactga ggggacctga ggcctgccag ctcctaccca ggttggactc tcagagagca
        2401 gggggagcgc gggcctgcca ttcctaatgg acaatgtacc ttgaacaggc tgccactcgc
        2461 tgaagccgtt ttcagttccc ttcttgattg ccaagatgcc tcaatgcaga ctggagccca
        2521 gaccctgcct ggtggctagc ggtcccgtgt tcagccaaag gtgaggacag agctgtccag
        2581 cattgtgaca ctggtggggc tagtttcttc cttgttcgtg gctgggtttc agtctcagag
        2641 ccccaccctc accaaggctc cacgcctctc acagctcccc catttatgcc taaacattct
        2701 ctcctcagaa cctcagctct tagtgagcca cttttcttgt gcaaaatgaa caatattaaa
        2761 gtttactact aatgagaacg tgtttctcct tagcctgggt ttccctaact tgcaaccggc
        2821 acccacatga cttgggggta gaaatgtgtt ttgtagtacc aatggtctca ccacagccca
        2881 agaagaacag tcccccacat ttctatctgg ttggtttcgt gacaaaaaat ggcaaagaa
        PCR条件:94℃7min,(94℃1min,58℃30s,72℃4min)×30,72℃10min。
        后来换了一对引物。
        上游引物:5' AgC AgC CAT gAg CTA CAT CAA TC 3'
        下游引物:5' gAg Tgg CAg CCT gTT CAA ggT AC 5'
        再用同样的条件扩增就完全没有产物了。
        各位帮帮忙啊,看看到底哪里有问题。
        谢了先。

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