🔥 巢式 PCR

使用扩增片段的内外两对引物进行两轮 PCR 扩增来提高引物与目的基因片段的特异性和灵敏性，以防止非特异性结合和非特异性产物的生成。

常规使用的一对引物的 PCR 可能会发生引物与模板的非特异性结合，为了提高特异性，选用目的基因内外两层引物进行两轮扩增，在前一轮的产物中进行二次筛选，双重保险以获得特异性的目的片段。

常用于高遗传变异性的病毒检测以提高检测率，也可用于常规 PCR 扩增产物时，核酸胶检测产物弥散高亮，但未出现明显条带时；也适用于模板质粒质量差或丰度较低时。

一、第一轮 PCR 扩增

目的 DNA 模板与第一对外侧的引物结合后进行 PCR 扩增。由于只有一对引物可能发生特异性结合，产物中会有目的基因片段和非特异性片段。

条件设置：

二、第二轮 PCR 扩增

使用目的基因内侧的第二对引物，即巢式引物，对第一轮的 PCR 产物进行扩增，双重筛选以调取目的基因片段。PCR 反应条件同第一轮。

三、PCR 产物的检测

将两轮 PCR 产物进行凝胶电泳分析，以检验产物片段大小是否正确，进行胶回收 DNA 纯化，转化后挑克隆送测序。

1、注意检测模板质粒质量以及各引物浓度；

2、外侧引物比内测引物的 Tm 值高 4 ℃ 以上；

3、外侧引物距离内侧引物要多于 6 bp；

4、第一轮 PCR 扩增时，应尽量摸索最低的外侧引物加入量，并增加扩增循环数，以消耗尽外侧引物，避免第二轮时继续扩增造成非特异性污染。

1、一轮用外侧引物 PCR 产物中出现非特异性条带

原因常见：

引物与靶序列不完全互补，非特异性结合用巢式 PCR 解决。但也可能是由于引物浓度过高、聚合形成二聚体/酶的质和量不佳/退火温度过低/ PCR 循环数过多所致，

对策：

必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93 ℃ 变性，65 ℃ 左右退火与延伸）等

2、PCR 扩增产物出现片状拖带/涂抹带

往往是由于模板质粒质量不好、酶量过多、dNTP 浓度过高、循环次数过多时引起，常规 PCR 出现非特异性结合的情况极少，建议先排查掉这些原因再进一步使用巢式 PCR。