半巢式 PCR

半巢式 PCR 是利用三条引物进行两次 PCR 扩增的方法，与巢式 PCR 原理相同，只是在第 2 轮 PCR 反应中使用的引物有 1 条为第 1 轮 PCR 的引物。

半巢式 PCR 的基本原理是当用于当模板 DNA 含量较低时，一次 PCR 难以得到满意的结果，需要进行两轮 PCR 扩增，与巢式 PCR 相比，在基因的 5' 末端或者 3' 末端无法设计出两条引物外引物和内引物，只能设计出一条引物的情况下，宜采用半巢式 PCR。

半巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）引物设计

在某些情况下，由于所要研究的基因位于整个基因组的 5' 末端或者 3' 末端，这样在基因的 5' 末端或者 3' 末端就无法设计出两条引物——外引物和内引物，只能设计出一条引物，而在基因的另一端仍然可以设计两条引物，在两次 PCR 中有一端的引物要利用两次，半巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同，共设计三条引物。内引物与外引物间隔多长距离没有统一的要求，具体情况根据每个实验而定。

（二）半巢式 PCR 反应：

A. PCR 反应体系：进行第一轮 PCR 反应，50 μl 的 PCR 反应体系，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：10× PCR 缓冲液 5 μl，DNA 模板 3 μl，2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.5 μl，10 μmol/L 的外引物（P1，P2）各 1 μl，最后加 H₂O 至 50 μl。

B. 如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油（约 50 μl）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

C. 设置 PCR 反应条件：预变性 94 ℃，3 min，变性 94 ℃，30 s，退火 55 ℃，30 s，延伸 72 ℃，60 s，30 个循环，延伸 72 ℃，7 min。

D. 进行第二轮 PCR 反应，在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：10× PCR 缓冲液 5 μl，第一轮 PCR 扩增产物 3 μl，2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl，Taq  DNA 聚合酶（5 U/μl）0.5 μl，10 μmol/L 的外引物（P1 或 P2）和内引物 P3 各 1 μl，H₂O 至 50 μl。PCR 反应条件同第一轮，反应中的条件与循环数视具体情况而定。

E. 有些情况下，也可进行一管式半巢式 PCR，例如 50 μl 的反应体系，分别加入：10× PCR 缓冲液 5 μl，模板 3 μl，2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl，Taq  DNA 聚合酶（5 U/μl）5 μl，10 μmol/L 的外引物（P1、P2、P3）各 1 μl，H₂O 至 50 μl。PCR 反应条件同第一轮，反应中的条件与循环数视具体情况而定。反应结束后，用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1、PCR 反应中的退火温度要根据引物的 Tm 值而定，延伸时间根据酶的合成速度和扩增条带的长度设定，一般来说每分钟合成 1 000 bp 左右。

2、半巢式 PCR 较巢式 PCR 反应特异性有所降低，易造成非特异产物，为了克服这个缺点，可以采取提高退火温度，从常用的 55 ℃ 提高为 60 ℃。从而使模板与引物之间的识别特异性提高，以提高反应的特异性。

3、半巢式 PCR 多采用第一轮产物直接稀释作为第二轮循环模板，此稀释混合物中的引物和模板对于第二轮扩增有一定干扰作用，易造成背景高、非特异产物多的缺点，通过对第一轮产物的初步分离获得纯化的核酸产物，再作为第二轮循环模板可得到更为理想的结果。