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        公司定的pcr引物如何验证是否合适?

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

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        yanlai000

        找公司定的pcr引物如何验证是否合适?

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        3 个回答

        user-title

        丁香清香

        有帮助

        可以用于正式实验的引物必须满足以下条件:

        a
        溶解曲线单峰,窄而尖,否则可能有非特异性扩增;峰的位置横坐标一般在80度以上,这个温度为PCR产物的解链温度,如果在75度附近,可能是引物二聚体,miRNA染料法检测时,溶解曲线的峰的位置可能在75度附件

        b
        琼脂糖电泳为明亮的一条带,条带一般在100bp以上,如果设计引物时PCR产物在100bp一下,需要仔细辨认是否为引物二聚体;引物二聚体的条带一般在50bp左右,条带弥散,暗。

        c
        扩增曲线呈“S”形,一般情况下,S形越陡,扩增效率越高,S形越平,扩增效率低。有时会出现扩增曲线只有线性期,没有指数期的情况,这时一般扩增效率较低,建议检测一下扩增效率,用标准曲线法计算相对表达量。染料法的扩增曲线比探针法的扩增曲线要好看。

        d
        样品Ct值小于30,对于Ct大于30的情况,建议重新设计一对引物,重新调试。如果几对引物的Ct值都较大,可以适当放宽Ct至35。但是Ct值肯定不能大于35。

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        做一次目的基因扩增和单引物扩增对照

        user-title

        whilt-shirt

        有帮助

        可以先用八连管跑一下看看扩增曲线和溶解曲线,根据这两个曲线判断引物是否合适

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