自己设计的引物，马上要送公司了，急请帮忙验证！
丁香园论坛
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1 gttaaaaatc tatagagatg gacactatcg ccgcaagagc actcactgtg atgcgagcat
61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga
121 tagctatcaa taggtacaat ggactcactt tacgaggagt gacgatgcgc ccgacctcgt
181 tagcacaaag aaatgagatg ttttttatgt gtttggatat gatgctgtct gctgctggta
241 taaatgttgg accgatatcg ccagactata ctcaacatat ggctacgatt ggtgtactag
301 caacaccgga aatacctttt acaacggaag cggcgaatga aatagctcga gtgactgggg
361 agacttcgac atgggggcca gcgcgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaga
421 ccttccaacc agggaggtgg ttcatgcgcg ccgctcaagc agtaactgca gtagtgtgcg
481 gtccggatat gattcaagtg tcacttaatg ctggagcgag aggagatgta caacagatat
541 ttcagggtcg taatgatccc atgatgatat atttagtgtg gaggagaatc gaaaactttg
601 cgatggcgca aggtaattca cagcaaactc aagcgggtgt gactgtcagt gttggtggag
661 ttgacatgag ggcgggacgc attatagcgt gggatggaca ggccgcgctg catgtgcata
721 atccgacaca acagaatgcg atggtgcaaa tacaggttgt gttctatata tctatggata
781 aaactttaaa ccagtacccc gctttgactg ctgagatttt caatgtttac agcttcaggg
841 accacacatg gcatgggcta agaacggcga tattaaacag aaccacactg ccaaacatgc
901 tgccaccaat cttcccacca aatgatcgag atagcatctt aactcttcta cttttatcta
961 cacttgctga tgtttacact gttttaaggc cagagtttgc gattcacggc gtaaatccga
1021 tgccagggcc gctcacacgt gctattgcgc gcgccgccta tgtgtagtcc actttgcacg
1081 ggtgtgggtt acatatgcgg tgtgtcggtt gtgggaaata tgtaacccat ttaaacgtct
1141 cttagattac acttac
以上是我要克隆的基因，本人用primer5.0设计的一对引物
正义为5‘cccaagctt atg gacac tatcg ccgca a3'从18位atg开始前面加的是Hind111酶切位点，有三个保护碱基ccc
反义为5’ccggaattc cacac cgcaa atgta accca3'从1085位开始，5‘端加的EcoL1酶切位点，保护碱基为ccg
这两天准备送出去，突然发现一些小问题
首先，我的反义引物中为了避免二聚体的形成，修改了一个碱基，将T改为拉A，不知道是否有影响
另外反义引物与另外一条模板（就是不是反义引物结合的这条链）1129位前面11个碱基有错配，反义引物本身位于1085。不知道是否会影响产物的生成
此外，一般计算Tm和引物长度时是不是不用将酶切位点算在内。我觉得我的引物似乎有点长，不知道有无影响！
正义引物（不考虑酶切位点）长19bp，Tm59.56 ，GC%为52。6％
反义引物（同上）长20bp ,Tm56.8 ，GC%为 50％
在此先谢谢各位大侠了！
61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga
121 tagctatcaa taggtacaat ggactcactt tacgaggagt gacgatgcgc ccgacctcgt
181 tagcacaaag aaatgagatg ttttttatgt gtttggatat gatgctgtct gctgctggta
241 taaatgttgg accgatatcg ccagactata ctcaacatat ggctacgatt ggtgtactag
301 caacaccgga aatacctttt acaacggaag cggcgaatga aatagctcga gtgactgggg
361 agacttcgac atgggggcca gcgcgtcagc cttatggttt cttccttgaa actgaggaga
421 ccttccaacc agggaggtgg ttcatgcgcg ccgctcaagc agtaactgca gtagtgtgcg
481 gtccggatat gattcaagtg tcacttaatg ctggagcgag aggagatgta caacagatat
541 ttcagggtcg taatgatccc atgatgatat atttagtgtg gaggagaatc gaaaactttg
601 cgatggcgca aggtaattca cagcaaactc aagcgggtgt gactgtcagt gttggtggag
661 ttgacatgag ggcgggacgc attatagcgt gggatggaca ggccgcgctg catgtgcata
721 atccgacaca acagaatgcg atggtgcaaa tacaggttgt gttctatata tctatggata
781 aaactttaaa ccagtacccc gctttgactg ctgagatttt caatgtttac agcttcaggg
841 accacacatg gcatgggcta agaacggcga tattaaacag aaccacactg ccaaacatgc
901 tgccaccaat cttcccacca aatgatcgag atagcatctt aactcttcta cttttatcta
961 cacttgctga tgtttacact gttttaaggc cagagtttgc gattcacggc gtaaatccga
1021 tgccagggcc gctcacacgt gctattgcgc gcgccgccta tgtgtagtcc actttgcacg
1081 ggtgtgggtt acatatgcgg tgtgtcggtt gtgggaaata tgtaacccat ttaaacgtct
1141 cttagattac acttac
以上是我要克隆的基因，本人用primer5.0设计的一对引物
正义为5‘cccaagctt atg gacac tatcg ccgca a3'从18位atg开始前面加的是Hind111酶切位点，有三个保护碱基ccc
反义为5’ccggaattc cacac cgcaa atgta accca3'从1085位开始，5‘端加的EcoL1酶切位点，保护碱基为ccg
这两天准备送出去，突然发现一些小问题
首先，我的反义引物中为了避免二聚体的形成，修改了一个碱基，将T改为拉A，不知道是否有影响
另外反义引物与另外一条模板（就是不是反义引物结合的这条链）1129位前面11个碱基有错配，反义引物本身位于1085。不知道是否会影响产物的生成
此外，一般计算Tm和引物长度时是不是不用将酶切位点算在内。我觉得我的引物似乎有点长，不知道有无影响！
正义引物（不考虑酶切位点）长19bp，Tm59.56 ，GC%为52。6％
反义引物（同上）长20bp ,Tm56.8 ，GC%为 50％
在此先谢谢各位大侠了！
