实验问答21,855,097 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问实时荧光定量 PCR 实验重复不出来是怎么个情况？

hml04010418

没有具体信息。每次条件的一致包括样本处理的一致。

5 回答3135 围观

问real-time PCR 与 reverse-transcription PCR 有什么区别？

woodeygao

reverse-transcriptionPCR是把提取的RNA逆转录成为cDNA，RNA——cDNA，靠的是逆转录酶；RT-qPCR，Real-Time定量PCR，是用来扩增DNA，和普通PCR方法不同是加入了荧光染料（楼上说的SYBR只是一种），通过检测器检测到荧光信号变化来对扩增的DNA进行定量，DNA-DNA，靠的是DNA合成酶和DNA外切酶。简单来说reverse-transcripti

5 回答13231 围观

问实时荧光定量 PCR 一定要设标准品吗？ΔCT 和 ΔΔCT 哪种方法好？

prime0711

我用的是ΔΔCT，没有用过标准品

4 回答2514 围观

问高保真酶怎么选择？

大明天桃子

传统的高保真酶例如pyrobest没有什么可说的，保真性一般是普通Taq酶的10倍以内。但传统的高保真酶最大的缺点是扩增能力差，长一点儿的基因很难有效扩增，要摸很多条件，一个字麻烦。最近可以买到的高保真酶选择的机会多一点儿了，有宝生的primer star，还有人提示的Taq plus（这个酶没有详细了解过），上述这两个酶的扩增能力我没有详细了解过，有兴趣的可以去打听一下。最高保真的酶可能要数NE

1 回答6020 围观

问如何根据CT值计算分析实验结果？

此用户已注销

内参大概16-22之间吧，太靠后也不好；目的基因，最好30之前，但有的情况，起峰会很晚，最好做无模版对照，即NC对照，NC理论上不会起峰，或在NC之前5-6个起峰的数值可用；

4 回答3596 围观

问同一批MIX，同一条件，同一批PCR，同一块胶，同一电泳，为什么差别就这么大呢

wisdyadong

胶配的不均匀！

8 回答3461 围观

问定量PCR的扩增曲线不平滑是为什么？

gjh731

1，体系不稳定，加大体系，2，如果是国产试剂的话可能这种现象算正常的，因为每次循环完后读荧光时，国产的染料不一定每次都结合的到DNA上，因此即使扩增出片的，也可能因为染料无法结合到DNA导致荧光值上下波动。3，引物扩增效率不高，非特异性不强，4，延伸出问题，可以考虑72度延伸时间增长，

3 回答3983 围观

问目的基因mRNA表达量一定会比GAPDH低吗？

tntztyx

可以在NCBI看一下spc的基因表达特异性

2 回答2879 围观

问做QPCR需要跑电泳吗？

修玛杨

紫外分光光度计检测的是RNA的浓度及是否有蛋白、酚类（就是在氯仿离心取上清的时候是不是吸到了中间层和下层，已经酒精洗异丙醇是否完全）的污染，而RNA电泳则是检测提取的RNA这个过程中是否有降解，如果是miRNA还好一些，如果是mRNA，一旦你的目的mRNA被降解了（也就是RNA电泳出现了3条以上的条带或者18s，28s不合格），那后续实验也就没有必要了。所以，我认为，要想出一个靠谱的实验，也为了避

2 回答6581 围观

问逆转引物的选择问题

parashorea

如果你的逆转录的目的是QPCR的话，选择同时含有oligo T 和Random primier双引物，如果你的目的是克隆基因的话，选择oligo dT.

2 回答1215 围观

问目的基因片段电泳鉴定无结果是为什么？

hl16010921

1.先对比引物序列，看序列是否真的评分很高（文献的也要自己重新查，文献审稿时引物错误是没人挑的）2.引物质量很重要，PCR不出结果，可以不付帐。换一家试试。有的公司引物合成时好时坏。3.引物的保存不当。4.PCR体系中有强的抑制Taq的物质（抽提污染或水的质量不高）5.是否有引物二聚体？有的话证明PCR还在进行，但条件不好。如果没有证明PCR没进行。6.dNTP降解也有可能。7。ULYSSEESW

2 回答2403 围观

问求助啊 Promega 的 Psi-check 2 vector 的测序引物是什么呀

iternol

psiCHECK-F GCAACTACAACGCCTACCTTCGG psiCHECK-R CGAAAAGGTCACACTCTGGGGCG你再网上找到质粒序列后就可以找到引物的位置了

2 回答2993 围观

问乙肝病毒的纯度 OD260/280 比值高是为什么？

alaling

如果不放心，比较好的办法是可以用RNA酶处理下。

3 回答1922 围观

问mg2+浓度是如何影响PCR扩增效率的?

我是金博士

PCR要用到聚合酶，酶的反应需要镁离子催化。

2 回答2545 围观

问请问裂解细胞进行检测，最少多少动物量就可以完整检测一次

月亮先生

我用七八万的目的细胞群，也能做出荧光定量的实验。就是出峰可能晚了一点

3 回答1362 围观

问PCR 时如果不同组加的 cDNA的总量不一样有影响吗？

phhcrab

管家（内参）基因必须做啊，不然发文章没戏

2 回答2434 围观

问在 NCBI 查询到人类的 CD209 有好多条 mRNA 该如何选取？

dengchch

有好多条mRNA是因为这个基因有不止一个转录本，一般情况下是选择最长的转录本进行克隆，当然如果别人有报道说不同的转录本有不同的功能的话最好还是都克隆并研究一下。基因的编码区和启动子序列在NCBI网站上都能查到，你搜索时用gene这个选项卡，然后搜你的基因，在结果中选人的该基因，然后分别去找相关信息。其中编码区就是CDS。设计引物时，如果你要克隆基因，那肯定引物要在CDS区两端，因为你要扩的是完整的

2 回答2604 围观

问异常PCR条带该怎么处理？

我是金博士

不知道你的目的条带是多大？PCR出现问题是很正常的，一般的解决办法是：（1）摸索PCR条件，优化模板浓度，温度梯度等；（2）重新设计引物。

2 回答1284 围观

问Western与RT-PCR的区别？

tao0129

这只是从不同的角度来分析，Western研究的是蛋白表达水平，RT研究的是转录水平，尽管二者都是研究基因表达的。但有一定差别，转录水平不完全等同于蛋白表达，因为它没有考虑到转录后调节的问题。但RT有一个好处，只有有序列就可以做，不象Western必须有抗体。并且RT可以研究同一基因不同亚型的表达，而同一蛋白亚型通常有多种基因型。选择哪一种须根据你的目的而言，能两种都做当然好，但有时候也会出现不相一

2 回答2020 围观

问p 一段 579bp 的基因，p 了 n 次都没成功是为什么？

benjimmy33108

如果就是第二个碱基一个有多态性，那么一般不会有多大影响的，建议你换一个聚合酶试一试，我P过很基因，有些基因就是有一些酶怎么设置都P不出来，结果其他几种可能就能P出来，或者你可以拿最普通的2X预混的先摸一下退货温度之后，看看能否P出来，再进行高保真的PCR.

2 回答2125 围观

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

实验小助手

扫码领资料

反馈

TOP

打开小程序