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求助|茎环法miRNA做RT-PCR内参和目的基因CT值差距大
秋秋欣欣
如果内参齐,然后目的ct值差异比较大,但是稳定的话也是可以用的
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问
请问,做qPCR实验,提取样品的RNA达到怎样的标准(如OD值,260/280),才比较符合做qPCR的实验的质量?
汤姆卜丽波
浓度要高一点,至少100+,然后260/280在2.0左右比较纯
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问
普通PCR跑出来的产物能定量比较么
秋秋欣欣
电泳只是能够看个大概,定量是不行的
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问
如何设计上下游引物引物,然后提质粒,并把目的基因转染到质粒里?
汤姆卜丽波
根据你目的基因的序列设计引物然后扩增,通过酶切连接,合成重组质粒
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问
qpcr用水代替模板上机,结果仍然有曲线,是引物的问题还是被污染了?
bamboopiggy
可能是引物二聚体,也可能是水被污染了,这个要更换其中一个进行判断
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问
PCR溶解曲线虽然为单峰,但峰看起来有点宽说明什么?
bamboopiggy
说明你的 引物不特异,有两个size差不多大小的产物产生
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问
PCR实验中,我的目的条带有出来,但是野生型的条带却未出来,这是为什么?
迟C迟
首先要确定野生型和你的样本之间目的基因的差异,是不是你的样本目的基因存在特异性,野生型就无法扩增出特异的目的基因。
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问
荧光定量PCR的基线,是怎么确定的呢?
bamboopiggy
基线就是一开始基本没有读值的那些线啊,你说的应该是读CT值得那个threshold 线吧,那个就是斜率最大得地方,的一条线,现在基本由机器自己去判断了
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问
我做PCR实验,有关引物的问题?
bamboopiggy
如果不加模板也能扩增出目的条带,就是说明引物或者你加进去的东西中的某一样污染了
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问
SYBR GREEN I染料需要严格避光吗?
bamboopiggy
不用那么严格,就是加好板子以后,如果不能立刻上机,最好避光保存。加板子的时候不用
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问
荧光定量qPCR的重复性好吗?
bamboopiggy
复孔是需要的,如果一个板跑不开内参和目的基因,可以分两个板跑,但是要求时间间隔不能超过一周,并且必须用同一台机器
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问
做pcr的时候曲线没有峰值,出来的数每个孔差异很大,怎么解决
bamboopiggy
1.确定机器是好的,2,确定引物能用 ,3加样的枪和枪尖要match
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问
请问pcr序列是这样的下一步怎么办
汤姆卜丽波
再严谨操作加一次样测一次,还是这样就要换引物
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问
混菌定量
迟C迟
可以,找到23srRNA序列,按照qPCR引物设计原则:1. 引物长度:18-25bp;2. GC含量:30%-80%,最好是40%-60%;3. 引物Tm值最好在60℃左右,上下游两条引物Tm差异不要超过4℃;4. 避免引物与目的基因之间发生错配,特别是引物3端,不要超过6个碱基;5. 避免特定碱基的连续重复,特别是引物3端出现3个或以上连续的C或者G重复;6. 避免引物自身形成发夹结构;7.
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问
做qpcr,样本较多,96孔板一次性跑不完所有样品如何解决?
balalaLy
分批做,每次每组选3个样,这样你就有三次生物学重复了,多好
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问
细菌做定量pcr,以cDNA做模板,pcr条带很杂,而用基因组做模板条带单一,这是什么原因?谢谢回答!
bamboopiggy
cdna是不同长度的,如果你的引物不是那么特异,产物就会很多。而genomic dna做模板,引物是跨内含子设计,比较长,非特异产物在30秒内扩增不出来
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问
请问半荧光定量引物怎么设计?片段大小设计多少合适?
天一湖医者
荧光定量一般限定在100-250bp间,半定量似乎没有太严格的限制,可以放宽到500-600bp吧
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问
请问在进行荧光定量时,一般qpcr片段应设计多大,一般情况下是80-180bp左右大小,但看其他文献有的设计片段大小240bp?
天一湖医者
荧光PCR主要包括两种形式一种是sybr green I技术,对片段长度没有特殊要求,一般100-400都可以,当然扩增片段越大,溶解曲线温度越高,有利于区别引物二聚体形成的溶解曲线,SYBR GREEN的特异性主要看引物;
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问
做某个细菌绝对定量需要找到这个细菌引物,然后通过模板DNA扩增成目的片段,然后再将目的片段导入到质粒中,再稀释成标准品。是这样吗
秋秋欣欣
是这样的,做细菌的定量,需要先找到目的片段的引物然后扩增
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问
链霉菌能否直接以基因组作为模板进行荧光定量PCR?
bamboopiggy
这个取决于你的实验目的,看你是要检测什么。是mRNA还是genomic DNA
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