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        用同源重组的方法构建载体,结果amp板上一个菌都没长

        相关实验:质粒构建技术

        user-title

        dxy_tz7bkwi6

        用同源重组的方法构建载体,结果amp板上一个菌都没长,以为是操作或者培养基的问题,但都单独试过没有问题。

        试过做阴性对照,用酶切后的载体片段去热激转化也没有菌长出来(师姐说酶切产物肯定会有残留片段没切开,应该会有几个菌长出来的),所以觉得很奇怪,到底是哪里出了问题呢

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        4 个回答

        user-title

        dxy_t3td6v30

        有帮助

        1.可能是载体质粒没提好,或者说载体抗性可能搞错了,所以长不起来。

        2.AMP抗性的板子配错了,或者说板子配方不对,导致长不起来。

        3.如果是切开了的空载,有可能会不长。

        建议:1.利用未酶切的载体试试,看是否是板子抗性或者配方的问题导致不长,如果板子的抗性和配方没问题,应该会长满。

        2.利用已有的连接成功的质粒,做阳性对照,如果它能长起来,就说明是你同源重组没连上,如果它的也没长,说明板子有问题。

        user-title

        dxy_tz7bkwi6user-title

        用未酶切的载体试过,热激转化成功了,可以长出菌,的确是同源重组没组上,有什么办法改进吗

        另外也试过用T4连接的方法,也没有办法把基因和载体连上,我的基因和载体总是连不上,到底是哪里出问题了(老师说长的片段本来就难连,但我的也就700bp或者1500bp)

        user-title

        dxy_br5187n

        有帮助

        平板使用抗性与转化的载体抗性需要保持一致。另外,我建议将菌液离心,移液枪吸取丢弃多余LB.培养基,保留100微升重悬,全部涂板。

        user-title

        dxy_tz7bkwi6user-title

        就是这样做的,拿1ml的无抗性LB先转化复苏一小时再去离心,去掉上LB,留大概100微左右涂板,但是长不出来(载体带A+,板子培养基也加了A+,浓度也没错)

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        那考虑是载体的问题,载体没有构建成功,可以检测一下是否是载体引物不匹配引起的

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        存在以下几个可能的问题:

        1. 载体质粒问题:确保你使用的载体质粒是正确的,具有所需的抗生素抗性基因。如果载体质粒有问题或没有正确构建,可能导致无法在抗生素选择培养基上生长。

        2. DNA浓度问题:确认使用的DNA浓度是适当的。过高或过低的DNA浓度可能影响转化效率和细胞存活率。确保在进行转化之前准确测量和调整DNA浓度。

        3. 电击转化参数问题:电击转化过程中的参数设置对转化效率和细胞存活率至关重要。确保使用适当的电击电压、电容和时间,并根据目标细胞的特性进行优化。

        4. 阳性对照验证:在构建载体的过程中,进行阴性对照实验是很重要的。确保在转化实验中包含正常的质粒DNA和酶切后的载体片段,以验证转化实验的有效性。

        5. 质粒纯化问题:质粒纯化步骤可能影响DNA质量和纯度,从而影响转化效率。确保使用高质量的质粒纯化方法,并验证质粒的完整性和纯度。

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