金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒（负压法），阿拉丁

产品简介： 

内毒素是质粒提取中常见的污染物，由于真核细胞对内毒素非常敏感，因此，如果质 粒中含有内毒素会大大降低真核细胞转染效率。本试剂盒提供一种快速、易大规模质粒制 备的新方法。每次可处理100-300 ml菌液，获得多至2 mg转染级质粒DNA。使用真空装置 可同时纯化多个样本，45分钟即可完成质粒提取，有效减少手动操作时间。特殊的缓冲液 系统和除内毒素过滤器，有效去除内毒素、基因组DNA、RNA、蛋白等杂质。本试剂盒所得 质粒纯度高、提取量大，特别适用于细胞转染，同时也可用于DNA测序，PCR，体外转 录，内切酶消化等实验。

自备试剂：无水乙醇、异丙醇、真空泵、废液收集装置、真空纯化装置。  

实验前准备及重要注意事项 

1．所有组分可在干燥、室温（15-30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2-8℃可保存更 长时间，加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。 2．Buffer P1 在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A 全部加入），混匀， 置于2–8℃保存。使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。 

3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。

4．使用前请先检查Buffer P2 和Buffer E3是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀现象， 可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。 

5．注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物质，请戴手套操作，使用后应立即盖紧盖子。 

6．使用Buffer PS处理过的吸附柱最好立即使用，避免放置时间过长影响使用效果。 

7．请准备废液收集装置/缓冲瓶CWE100、真空纯化装置CWE200、真空泵CWE300。

操作步骤 

1．取100-300 ml过夜培养的菌液，加入离心管（自备）中，12,000×g离心2-3分钟收集细菌， 尽量吸弃全部上清。 

2．向留有菌体沉淀的离心管中加入12 ml Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A）， 使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。 注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。 

3．向离心管中加入12 ml Buffer P2，温和地上下颠倒混匀8-10次，使菌体充分裂解，室 温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。 

注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如 果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。 

4．向离心管中加入12 ml Buffer E3，立即上下颠倒混匀8-10次，此时出现白色絮状沉 淀，室温放置5分钟。将溶液全部倒入除内毒素过滤器（Endo-Remover FQ）中，慢慢推动推柄（Plungers）过滤，滤液收集在干净的50 ml离心管（Centrifuge Tubes）中。 

注意：1）Buffer E3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。 

2）加入E3后，若出现沉淀过多的情况，可12,000×g离心10分钟后，再将上清溶液倒入除内毒素过滤器中。 

5．向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀。 

注意：加入异丙醇过多容易导致RNA污染。 

6．正确连接负压装置，将连接管（VacConnectors）与DNA吸附柱（DNA-Binding Tubes）连接好后插到负压装置的插口上。 注意：确保连接管和吸附柱连接稳固，防止发生漏气。 

7．柱平衡：向DNA吸附柱（DNA-Binding Tubes）中加入2 ml Buffer PS，开启并调节负压至-300~-700 mbar，吸去柱上溶液。

8．将步骤5中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中，吸去柱上溶液。 

9．向DNA吸附柱（DNA-Binding Tubes）中加入10 ml Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），吸去柱上溶液。 

10. 重复步骤9。 

11.保持负压抽吸10分钟，除去吸附膜内残留漂洗液，干燥吸附膜。若一次抽吸6个样品以上，可将负压抽吸时间适当延长。待吸附膜彻底干燥后，关闭负压开关 。

注意：1）这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、 12.PCR等）。 

2）根据吸附膜干燥情况，决定负压装置抽吸时间。如未彻底晾干，也可增加烘干步骤，65℃烘干30 min以彻底晾干吸附膜内残余的溶液。

12.将压力恢复至0 mbar时，取下吸附柱，将DNA吸附柱置于一个新的50 ml离心管（Centrifuge Tubes）中，向吸附膜的中间部位加入1-3 ml Endo-Free Buffer EB， 室温放置2-5分钟，12,000×离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。 

注意：1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到DNA吸附柱（DNA-Binding Tubes）中，室温放置2-5分钟， 12,000×g离心5分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

2）质粒拷贝数较低或>10 kb时，Endo-Free Buffer EB在65－70℃水浴预热，可以增加提取效率。