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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
对于pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的根本区别在哪里?
dxywode
一、方法不同1、普通pcr引物设计:引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。2、荧光定量pcr引物设计:通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,标记跟踪PCR产物进行实时监测反应,利用与之相适应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度二、原理不同1、普通pcr引物设计:为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。2、荧光定量pcr引物设计:在PCR反应体系中加入荧光基团
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问
可以在两个融合蛋白间的linker边上再加酶切位点吗?
天一湖医者
这个看情况,如果linker不是很长,可以在引物合成的时候直接合成进去。
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问
电转导质粒总是不成功?
dxy_g9y5gije
首先你考虑一下感受态细胞有没有问题,考虑转其它成功过的质粒尝试其次考虑一下其他转导方式比如说化学转导
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问
pcr扩增效率E表现不好怎么办?
汤姆卜丽波
这种情况先确定你的模板纯度,然后引物是否匹配,退火温度和循环数可以做梯度摸索
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问
琼脂糖凝胶电泳条带扭曲
bamboopiggy
可能是你的胶没有配匀,或者是你pcr产物的浓度抬高了。
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问
转座子反向PCR 的问题
天一湖医者
查一下LM-PCR,按照步骤做就好,也有可能是你引物设计的不对,要仔细分析序列。
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问
构建载体一直构建不上,可咋整?
天一湖医者
1.确保克隆到的基因完全正确:如果这一步出问题,无非两点原因:引物设计不合理,模板质量不高。解决方法:多找几个模板同时进行克隆;重新评估引物的合理性和特异性,比如将引物长度增至40 bp左右。2.关于酶切酶切其实要求并不十分严格,正常操作下,不论电泳检测是否十分清楚,酶切产物足够连接用量了,没必要纠结。
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问
为啥这个文章要在CDS这样靠后的区域去设计sgRNA呢?
bamboopiggy
全文没有读过,但是看这个表述,设计gRNA的位置靠近跨膜区,是不是主要为了 影响跨膜区的那一段啊?
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问
请教:细菌病毒的核酸怎么不能用A260鉴定提取好坏?
汤姆卜丽波
核酸提取好坏的鉴定是根据260/280以及260/230的,不单单是 260
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问
菌液pcr有明显条带,但是测序结果显示并非构建成功 怎么回事?
bamboopiggy
可能你的片段和空载同时转到了菌里,所以pcr能p到,但是因为没有连接成功,所以测不到
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问
双链DNA琼脂糖电泳没有任何条带,但是聚丙烯酰胺核酸电泳有条带.DNA和抗体偶联,两个都没跑出来条带,这是为什么呀
天一湖医者
有很多可能性:1.样品中没有dna,或者dna太少,或者dna已经降解。2. dna较小而电泳时间太长,导致dna跑了出去。3. dna太大,还在加样孔附近,甚至还没有跑到胶里。
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问
新冠病毒检测曲线从起点就向上趋势是什么原因?
天一湖医者
可能原因,软件在进行基线自动扣除的时候出现错误,引起了扩增曲线抬升。或探针浓度过高,体系中有荧光物质污染,扩增效率低。
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问
1000条氨基酸如何获得比对序列结果图?
汤姆卜丽波
ncbi序列对比后你可以做一个表,把相似度比值从高到低排布,然后取高度相似的几个图表示,其余作为补充材料上传就可以了
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问
双酶切体系,BamH I30℃和Xho I37℃。如果分布酶切,官网写的1×K Buffer要用10×的稀释吗?如果一步酶切,温
bamboopiggy
不能一步酶切,俩温度不一样,最好分开切。buffer是要用10X的稀释成1X的
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问
质粒酶切后的回收可以不跑胶直接PCR回收吗?
迟C迟
不可以,直接PCR产物回收的有好几种片段,不是你要的目的片段,会降低后续实验准确性。
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问
地贫基因gapPCR电泳条带有粗、细,与标本浓度有关?
棋NKKP
不仅与浓度有关,与样品的质量,胶的质量,核酸染料甚至是电泳条件都有关
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问
造成 qPCR 实验中无逆转录酶阴性对照出现假阳性的可能原因有哪些?
whilt-shirt
有可能是误加了有逆转录酶的试剂
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问
最近酶切连接转化后一直没菌落,一般问题出在哪
棋NKKP
这个涉及的就比较多了,可能载体构建时设计的问题,或者筛选的条件不合适,或者培养条件不合适,或者感受态转化效率低,可以考虑设置对照去检查自己的实验体系
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问
可以用于 DNA 差异筛选杂交的探针有哪些?
bamboopiggy
杂交探针是核酸分子上带有可能被检测的信号分子,如同位素或荧光标记的核酸分子。双链DNA加热变性成为单链,随后用放射性同位素(通常用磷-32)、萤光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中,而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。分为cDNA探针,基因组DNA探针,寡核苷酸探针,RNA探针。
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问
逆转录实验体系中 RNA 模板的用量与哪些因素相关?
天一湖医者
与浓度,质量,循环次数,样本量等有关
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