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        菌液pcr有明显条带,但是测序结果显示并非构建成功 怎么回事?

        相关实验:利用 PCR 分析酵母菌落

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        JIYVD92

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        3 个回答

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        可能你的片段和空载同时转到了菌里,所以pcr能p到,但是因为没有连接成功,所以测不到

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        菌液pcr假阳性,以测序结果为准

        user-title

        未来9

        有帮助

        菌落pcr的假阳性很多,也有很多原因,所以一般都是需要测序结果佐证的。
        1,引物设计不合适:选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行 PCR 扩增时,扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。
        2,靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因:一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出 PCR 产物,而导致假阳性的产生,可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。

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