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四聚体染色技术【试剂与设备】（1）待检细胞：PBMC，脾细胞，淋巴结细胞或经过相应病毒感染细胞（注意其HLA-A型别）刺激形成的CTL细胞（2）FACS缓冲液（FB）：PBS+2%小牛血清+0.1%叠氮钠（3）2 X HLA-I/抗原肽四聚体：2倍使用浓度的HLA-I/抗原肽四聚体（4）1%多聚甲醛(PFA)的PBS（5）离心机（6）流式细胞分选仪（7）加样器、吸头等【操作步骤】（1）将待检细胞 ...

噬菌体展示抗体库构建目的基因的获得PCR引物的设计 利用PCR技术扩增抗体VH和VL基因所获得的产物需要满足以下两个要求：首先得到的产物必需是正确的目的基因要有可靠性；其次要获得尽可能多种类目的基因即有多样性。因此设计出合理的扩增引物十分重要。 哺乳动物功能性抗体基因是由种系基因在DNA水平上重排产生的。以小鼠的抗体重链为例VH基因由V、D、J三部分构成。在小鼠第12号染色体上大约 ...

电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备 【材料和试剂】 （1）恒温旋转式摇床 （2）三角烧瓶（容量为1或2L） （3）50ml灭菌离心管 （4）低温高速离心机 （5）SB培养基 细菌培养用胰化蛋白胨 20g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCl&n

PCR扩增模板和抗体可变区基因的扩增 如果构建Fab抗体库必需利用RT-PCR获取抗体基因;构建ScFv抗体库既可以DNA作模板也可以cDNA作模板。本室在构建小鼠ScFv抗体库过程中主要采用DNA作为扩增模板。【材料和试剂】（1）PCR仪（2）Taq酶（3）氯仿（4）琼脂糖【操作步骤】（1）在200μl离心管中混匀下列成分： 模板DNA 5μg 10×P ...

抗体库的构建 【材料和试剂】 （1）电转仪（2）电击杯（3）SB培养基（4）SOC培养基SB培养基经高压灭菌后，降温至60℃或60℃以下，加入20ml经过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。50mg/ml氨苄青霉素水溶液，过滤除菌。10mg/ml 卡那霉素水溶液，过滤除菌。4% PEG溶液 【操作步骤】 （1）将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min转 ...

PCR产物的酶切 经过电泳回收的PCR产物直接酶切的效果往往不佳。这主要是因为酶切位点太靠近片段两侧缺乏足够多的保护碱基。要克服这一问题要么在最初引物设计时加上较多的保护碱基要么用过量的限制内切酶长时间消化。而后者的效果并非特别理想。我们尝试首先将PCR产物互相平连再以过量限制性内切酶长时间消化得到了较好的效果。这种方案的潜在危险在于当酶切仍不完全时最后得到的片段两端很可能带有同一种酶的识 ...

分泌型ScFv的产生 【材料和试剂】 （1）SB培养基 （2）20mol/L MgCl2溶液 （3）50mg/ml 氨苄青霉素溶液 【操作步骤】 (1)将用ELISA检测有活性的克隆扩大培养制备质粒DNA。 (2)转化E.coli DH5α或 JM83(注意:必须是非supE菌株才能表达分泌型抗体); (3)挑选单克隆接种于10ml SB中其中还含有20m ...

筛选多肽的试剂及配制LB培养基：胰蛋白胨 10g； 酵母提取物：5g； NaCl：5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，室温保存。IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。 ...

阳性克隆的筛选(panning) 一个筛选实验包括数轮识别和复制过程。在每一轮中特异性结合的克隆被选择和扩增。这些克隆在大约3～5轮之后便可居于多数。每轮的富集系数约为102～103因此3轮之后一个特异结合克隆将富集106～109倍。 【材料和试剂】 （1）ELISA板 （2）湿盒 （3）0.1mol/L Na2CO3(pH8.6) （4）3％BSA （5）TBS ...

噬菌体展示技术筛选多肽 噬菌体肽库的构建 噬菌体肽库的构建多选用基因合成法，步骤类似于噬菌体抗体库的构建：即化学合成编码各种序列某一长度肽的寡核苷酸片段（如构建的肽文库是由6个氨基酸残基组成，就应含有206种不同的氨基酸序列，即约109种不同密码子的组合），然后通过DNA重组方法，插入到表达载体上的外被蛋白基因（如基因III或基因VIII）中，再利用电穿孔技术，将各种重组体转入大肠杆 ...

筛选多肽的操作步骤第一天以0.1M NaHCO3（pH 8.6）制备100mg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。在每孔内加入1.5ml靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。第二天将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。如 ...

ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力 【材料和试剂】 （1）酶标板 （2）酶标仪 （3）0.5mol/L Na2CO3(pH9.6) （4）1％BSA （5）HRP标记的抗M13噬菌体多抗 （6）2mol/L H2SO4 【操作步骤】 (1)将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml; (2)对于要检测的每个 ...

测序模板的快速纯化【材料和试剂】（1）真空泵（2）PEG/NaCl溶液（3）碘化物缓冲液（4）70%乙醇（5）TE缓冲液 10mM Tris-HCl，pH 8.0； 1mM EDTA【操作步骤】（1）扩增噬斑（见上述），在第一次离心后，将500ml含有噬菌体的上清转入新的离心管中。（2）加入200ml PEG/NaCl，颠倒混匀，室温静置10min。（3）离心10min，倾去上 ...

噬斑的扩增【材料和试剂】（1）恒温摇床（2）培养管（3）LB培养基（4）甘油【操作步骤】（1）以LB培养基稀释ER2537过夜培养物。1ml分装至培养管，每管中接种一个克隆。第三轮筛选后，每10个克隆就可能获得一个共同序列。（2）使用消毒牙签或枪头，穿刺噬斑，接种至上述培养管中。注意：要挑选噬斑数不超过100的平板上的噬斑，从而保证每一个噬斑仅包含单个DNA序列。（3）37℃振摇孵育4.5~5 ...

索取（购买）抗体的环节 所有已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或者供应非常短缺，作者才会婉转地拒绝。所用单抗一般都会毫无保留地提供，而多克隆抗体的产量有限，不足以为申请者提供大量所需试剂。如果抗体生产是为了销售，申请人应该付款。在需要大量抗体时，如制备抗体亲和柱，有时为获得足够的抗体和纯化的抗体，申请人和抗体提供者间应寻求一个可接受的解决办法。 ...

ELISA检测筛选到的靶分子结合肽【材料和试剂】（1）酶标板，酶标仪（2）湿盒（3）吸水纸（4）LB培养基（5）PEG/NaCl（6）TBS（7）0.1M NaHCO3（pH 8.6）（8）HRP底物缓冲液 ABTS贮存液：在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液（pH 4.0）中溶解22mgABTS，过滤除菌贮存在4℃。【操作步骤】（1）噬斑扩增上清部分用于DNA序列测定，其余保存于4℃。（ ...

噬菌体滴度的测定 在宿主细胞过量的情况下，噬斑的数量随着噬菌体的增加呈线性增加。由于这个原因，在感染以前，要将噬菌体进行稀释，而不是将宿主细胞稀释。以低MOI（感染重复性）铺板，也可确保每一个噬斑仅包含一个DNA序列。【材料和试剂】（1）微波炉（2）LB/IPTG/Xgal培养板（3）LB培养基（4）顶层琼脂糖凝胶【操作步骤】（1）在5~10ml LB培养基中接种单个ER2537克隆， ...

抗体的命名规则 近年来，已召开过多次描述种类的来源、免疫原和抗体类型标准的大会，并加以综合简单的做了一些规定，但需要做一些解释。免疫原通常根据种类的来源确定，前面总是加前缀“抗―”。所以，如果涉及针对脊椎动物刺猬(一种从鼠演化而来的动物)的抗体，就可将试剂写成抗鼠―刺猬的抗体，或者抗鼠―刺猬的免疫球蛋白。产生抗体的种属名总是放在抗体名称的前面，如果是在大角野山羊体内产生的抗体，相应的抗体就 ...

噬菌体肽库的应用一、在生物活性小肽筛选方面的应用 具有生物活性的小肽，如酶抑制剂，受体的激活剂或拮抗剂等，具有重要的基础研究及应用价值。因此，寻找和研究这些小肽一直是生物化学和药物研究中的一个热点。通常，这些小肽可通过合理的体外设计师合成或从化学合成的混合物中分离。但前者需要详细的分子结构信息，而后者又费力、耗时且价格昂贵。而通过噬菌体表达的随机肽库技术则可简便有效的筛选到高活性的小肽，而 ...

基因组结尾 鸟枪法序列数据组装成毗连序列群通常会导致超过99％的基因组被覆盖，并有很多间隙将各个毗连序列群分隔开。间隙通常来自未在基因组文库中出现的区域(如在大肠杆菌中克隆时对宿主有毒性的区域)、质量较差的序列(如来自那些因为具有二级结构而妨碍测序反应的区域)和／或复杂的重复结构。基因组结尾过程的第一步包括利用正向信息和反向信息将毗连序列群连接成大的框架。利用软件例如Bambus(Pop， ...