PCR扩增模板和抗体可变区基因的扩增
互联网
3188
PCR 扩增模板和抗体可变区基因的扩增
如果构建Fab抗体库,必需利用RT-PCR获取抗体基因;构建ScFv抗体库,既可以DNA作模板,也可以cDNA作模板。本室在构建小鼠ScFv抗体库过程中,主要采用DNA作为扩增模板。
【材料和试剂】
（1）PCR仪
（2）Taq酶
（3）氯仿
（4）琼脂糖
【操作步骤】
（1）在200μl离心管中混匀下列成分：
模板DNA 5μg
10×PCR缓冲液 10μl(含25mmol/L MgCl2)
5’引物 20pmol
3’引物 20pmol
Taq酶 5U,加超纯水至100μl,石蜡油1滴。
（2）93℃预变性2min,然后94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,反应进行30个循环后,再72℃延伸10min；
（3）将反应物冷却至室温，用等体积氯仿抽提去掉石蜡油,水相转移到一个干净的离心管中,取5μl在1.5％的琼脂凝胶上电泳，观察扩增产物大小,重链产物在370～390bp左右,轻链产物在340～360bp之间。
（4）利用PAGE或琼脂糖凝胶电泳回收合适大小的DNA条带。当采用琼脂糖凝胶电泳回收时,不能使用Bio101公司的Geneclean Kit回收,该产品只适于回收大于500bp的DNA片段。而Promega公司的WizardTM PCR纯化kit的回收效率在80％以上。
在PCR扩增中要将5’端引物与3’端引物逐一配对,工作量较大。采用混合引物或简并引物扩增可以减少配对扩增的数目,但效果并不总是十分理想。
