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        ELISA检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力

        互联网

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        ELISA 检测噬菌体抗体与目的抗原的亲和力

        【材料和试剂】

        (1)酶标板

        (2)酶标仪

        (3)0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)

        (4)1%BSA

        (5)HRP标记的抗M13噬菌体多抗

        (6)2mol/L H2SO4

        【操作步骤】

        (1)将抗原用PBS或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀释至10μg/ml;

        (2)对于要检测的每个克隆,至少包被2个孔,每孔用200μl稀释抗原。同时包被阴性对照抗原。此外,包被阳性对照抗原,阳性对照抗原用anti-M13抗体;

        (3)室温包被1~2h,最好于4℃过夜包被,甩掉孔中液体,倒置于纸巾上空干。

        (4)每孔中用至少200μl 1%BSA封闭,37℃1h。去掉液体后空干。

        (5)将重组噬菌体事先用等体积的封闭液于室温下封闭15min~30min,以封闭各种蛋白质之间的非特异性结合位点。

        以M13噬菌体作为阳性对照噬菌体,也按上述步骤操作。

        (6)在每个包被抗原孔中,加入稀释的重组噬菌体悬液200μl,37℃ 1~2h。在包被了阳性对照抗原的孔中,加入200μl阳性对照噬菌体。

        (7)去掉孔中液体,倒置于纸巾上。将板浸入PBS/0.5% Tween20(PBST)中,振荡赶走气泡,将板取出。重复洗涤5遍。

        (8)将板倒置于纸巾上,去掉所有液体。

        (9)将HRP酶标的Anti-M13抗体用封闭缓冲液稀释至合适浓度。

        (10)在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀释液。

        (11)37℃温育1h。按前述方法洗涤6次。

        (12)每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30% H2O2。在每孔中加入200μl。

        (13)置室温20~60min,直至出现适中的颜色反应。加入2mol/L H2SO4终止反应。

        (14)于415nm波长下用酶标仪读出光吸收值。良好的数据中,噬菌体抗体与筛选抗原的吸收值应当比阴性对照抗原的吸收值高2~3倍。

        从Pharmacia公司可以购买用于检测噬菌体抗体的试剂盒,也可以制备抗M13噬菌体的多抗。关于噬菌体抗体的检测,也可以采取其他方法,应当根据实际情况而定。

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