阳性克隆的筛选(panning)

一个筛选实验包括数轮识别和复制过程。在每一轮中，特异性结合的克隆被选择和扩增。这些克隆在大约3～5轮之后便可居于多数。每轮的富集系数约为10²～10³，因此，3轮之后一个特异结合克隆将富集10⁶～10⁹倍。

材料和试剂

1. ELISA板

2. 湿盒

3. 0.1mol/L Na₂CO₃(pH8.6)

4. 3%BSA

5. TBST

操作步骤

1. 识别

① 用25μl抗原(0.1～1μg/孔)于4℃包被ELISA板过夜。抗原溶解于0.1mol/L Na₂CO₃(pH8.6)中。

② 甩去孔中液体，用去离子水洗涤2次。

③ 用3%BSA封闭,隔绝空气或置于潮湿的容器中温育。

④ 37℃1h后，甩去液体。

⑤ 每孔加入50μl噬菌体悬液(共10¹²pfu)。

⑥ 封好孔置于湿盒中，37℃ 2h。

⑦ 去掉噬菌体，加满TBS/0.5% Tween 20(TBST)，剧烈上下吹打。放置5min，去掉TBST。在第一轮中用TBST洗1次，第二轮洗5次，以后各洗10次。

⑧ 每孔加入50μl洗脱缓冲液(0.1mol/L HCl，用甘氨酸调pH至2.2/BSA 1mg/ml)。室温放置10min，剧烈地反复吹打。转移洗脱液至离心管内，用3μl 2mol/L Tris中和。也可用适当浓度的筛选抗原竞争洗脱。

2. 复制

① 用洗脱液感染2μl新鲜TG1(OD600=1),室温下温育15min。

② 加入10ml 37℃的SB(含20μg/ml Amp)，立即取10μl、1μl涂布LB平板(含100μg/ml Amp)。将此培养物37℃振荡培养1h。

③ 将Amp补加至50μg/ml，37℃培养1h。

④ 加入辅助噬菌体M13KO7共10¹²pfu，一般为1ml。

⑤ 转移至100μl SB中，Amp为50μg/ml，37℃培养2h。

⑥ 加入卡那霉素至终浓度70μg/ml，37℃培养过夜。

⑦ 4000r/min离心(4℃)15min，转移上清并按前面步骤提取噬菌体。然后进行下一轮筛选。

测定噬菌体悬液滴度时，应取1μl悬液稀释至10^-3、10^-6、10^-8，加入50μl新鲜的TG1细胞(OD600=0.5)，室温下感染15min，涂布于LB平板(含100μg/ml Amp)上