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        筛选多肽的操作步骤

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        第一天

        以0.1M NaHCO3(pH 8.6)制备100mg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子,可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。

        在每孔内加入1.5ml靶分子溶液,重复涡旋直至表面完全湿润(这一步要多注意,尽量避免溶液形成液珠)。

        在湿盒中,4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。

        第二天

        将ER2537(滴度测定时用来铺板的细菌培养物)接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体,也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中(比例为1:100)。37℃剧烈振摇。

        将平皿反扣在洁净的纸巾上,去除包被液,加满封闭液,4℃孵育至少1h。

        去除包被液。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液(也可利用自动洗板机洗涤)。洗涤要迅速,避免平皿干燥。(注意每次更换纸巾,以免交叉污染)。

        用1ml TBST稀释4′1010噬菌体(10ml原库),加至包被后的平皿内,室温下轻缓摇动10~60min。

        以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。

        以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次,每次换用洁净的纸巾,避免交叉污染。

        用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体(0.1-1mM)的TBS,或是含有靶蛋白(~100mg/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10~60min。将洗脱液转入微量离心管中。

        10a.或使用通用缓冲液,0.2M的甘氨酸-盐酸(pH 2.2),1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过10min,将洗脱物转入微量离心管中,以150ml 1M Tris-HCl(pH 9.1)中和。

        取小量洗脱液(~1ml)测定滴度,如果有必要,可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序(见后续操作)。(未用的洗脱物可4℃保存过夜,第二天进行扩增。在这种情况下,用LB过夜培养ER2537,第二天,用LB培养基以1:100将该培养物稀释至20ml,加入未扩增的洗脱液,在250ml的锥形瓶内,37℃剧烈振摇孵育4.5h,进入步骤13)。

        将剩余的洗脱物进行扩增:将洗脱物加入20ml ER2537培养物中(对数早期),37℃剧烈振摇孵育4.5h。

        将培养物转入微量离心管中,4℃,10,000转离心10min,将上清转入新的离心管中,再次离心。

        将80%的上清转入新的离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体至少60min或过夜。

        第三天

        4℃,10,000转离心PEG的沉淀物15min,倾去上清,再次离心,吸去多余的上清。

        用1ml TBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中,4℃离心5min使残留的细胞沉淀。

        将上清转入新的离心管中,用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀,冰上孵育15~60min。4℃离心10min,弃上清,再次短暂离心,用微量枪头吸去残留的上清。

        用200ml TBS,0.02%NaN3悬浮沉淀物,离心1min,将上清转入新管中,即为扩增的洗脱液。

        测定洗脱物在扩增后的浓度,贮存于4℃。

        包被平皿进行第二轮筛选,同步骤1~3。

        第四和第五天

        计数蓝色噬斑,确定噬菌体的滴度,计算对应于1-2′1011 pfu的噬菌体体积。如果滴度太低,在筛选时可采用对应于109 pfu的噬菌体体积。

        进行第二轮筛选:重复步骤4~18,用含1-2′1011 pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选,将洗涤液中的Tween 20浓度增至0.5%。

        测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。

        包被平皿进行第三轮筛选,步骤1~3。

        第六天

        进行第三轮筛选:用第二轮扩增洗脱液中1-2′1011 pfu噬菌体进行筛选,洗涤时,Tween20的浓度仍为0.5%。

        测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。如果不进行第四轮筛选 则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序:平板的孵育时间不得长于18h,因为时间过长可能造成噬菌体感染率下降。将剩余的洗脱物保存于4℃。

        选取单克隆ER2537过夜培养。

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