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        抗体库的构建

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        抗体库的构建
         
            【材料和试剂】
            (1)电转仪
        (2)电击杯
        (3)SB培养基
        (4)SOC培养基
        SB培养基经高压灭菌后,降温至60℃或60℃以下,加入20ml经过滤除菌的1mol/L葡萄糖溶液。
         50mg/ml氨苄青霉素水溶液,过滤除菌。
         10mg/ml 卡那霉素水溶液,过滤除菌。
         4% PEG溶液
            【操作步骤】
            (1)将第4步得到的连接物与300μl感受态细菌混匀旋转1min,转移到电穿孔小槽中电脉冲穿孔。
            (2)电穿孔时的参数可选择2.5kV,0.2cm电击杯,25μFD和200欧姆(BioRad公司的Electroparation Pulser)或用BioRad公司的E.coli Pulser转化。立即冲洗电击杯,先用1ml,然后用2ml室温SOC冲洗细菌,立即于37℃振荡培养(250r/min)1h。
            (3)加入10ml 37℃预热的SB(含20μg/ml氨苄青霉素,Amp),立即涂布平板,做100μl,10μl,1μl三种涂布;
            (4)其余培养物于37℃振荡培养(以下均为300r/min)1h,补加Amp至终浓度为50μg/ml,再于37℃培养1h。
            (5)将培养物全部转接于100ml含50μg/ml Amp的SB中,37℃过夜培养。
            (5a)制备质粒DNA,插入另一条链的可变区基因。通常先构建轻链库,再构建重链库;回到步骤(1)将第二条链插入已构建的第一链的库中。插入第二条链后,进行步骤(6),省略步骤(5)和(5a)。
            (6)加入辅助噬菌体M13K07 1012pfu;将培养物转入100ml SB(含50μg/ml Amp),37℃振荡培养2h。
            (7)加入卡那霉素至70μg/ml,30℃或37℃振荡培养过夜。
            (8)4000r/min离心细菌,4℃ 15min,将上清转移至一个干净的无菌瓶中,加入4%PEG 8,000和3%NaCl,用摇床振荡5min以使其溶解。
            (9)冰浴沉淀噬菌体30min。
            (10)9000r/min离心(4℃)20min弃上清。在纸巾上吸干10min,尽可能除去PEG。
            (11)用2ml TBS/1% BSA重悬,转移入5ml离心管中,14,000r/min离心5min,取上清贮存4℃(长期保存应加入0.02%NaN3)。只有新鲜制备的噬菌体可以用下面的筛选,因为残存的蛋白酶很容易将ScFv从噬菌体表面切下。长期贮存的制备物应重新感染扩增再用于筛选。
            (12)从离心的细菌中制备噬菌粒DNA,贮存。
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