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对于一些生物测序公司（ 如Invitrogen等），我们的菌液或质粒经过PCR和酶切鉴定都没问题，但几天后的测序结果却无法另人满意。为什么呢？PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们所用的T载体克隆PCR产物就是应用该原理，通常PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿峰），也就是双脱氧核甘酸 ...

刚进实验室学技术 ，看到复旦大学某教授写的有关质粒的好文，贴在这里与大家共享（最后的问题也希望各位能解答一下：）：从质粒抽提谈起碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技 术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生 却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实 验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的 ...

〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓 2007年零应助帖/疑难帖集合〓〓〓〓〓〓〓〓〓〓 已应助帖不代表求助已经解决，鼓励战友继续积极应助，加分机会与尚未应助帖均等不规范贴不在此次整理范围，请大家规范发贴1.请问pcDNA3.1能作为RNAi的质粒载体使用吗？http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=9188774&sty=1&tpg=32&age=02.点突变没结果http://www.dxy.cn/bbs/post/view?b ...

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两 ...

问题：原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割：1) 内切酶失活标准底物检测酶活性2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3) 条件不适（试剂、温度）检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如S ...

RNAi介绍1. RNAi现象RNA 干涉（或者叫做RNA干扰）指的是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。在一些生物系统中，少量拷贝的双链RNA能导致细胞内所有同源基因的降解。这个现象在进化过程中保守而且广泛，许多基因在这个过程中发挥了重要的作用。 人们发现这个现象在线虫、昆虫、哺乳动物、植物和真菌中广泛存在。而在RNAi现象在线虫中发现之前，其机制被认为是一种转录后基因沉默，共抑制或者是压制，被认为是 ...

蛋白标签（protein tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。一、 新型蛋白标签蛋白标签应用极为广泛，但仍有两个问题不容忽视：（1）蛋白标签以DNA形式编码，它需要转录并翻译成蛋白后才能发挥作用，而这种作用方式本身就是一种缺陷。例如，常用的荧光蛋白标签，在显微镜下观察时，其显 ...

外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两 ...

本人持有以下载体及基因：（原则上只交换不赠送，欢迎广大站友互通有无）QQ 2283524599 luckamily@126.com一、载体1)、miRNA载体Promega miRNA靶标克隆载体 psiCHECK-2 psiCHECK2 ampAmbion miRNA靶标克隆载体 pmiR-report pmiRreport ampInvitrogen miRNA过表达载体 PCDNA TM 6.2-GW/EmGFP-miR2)、哺乳动物/真核表达载体pcDNA3.1+ 不 ...

在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中,都需要使用寡核苷酸作为探针或引物,而对这些反应的质量起最重要影响作用的,就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果,而用不够合适的寡核苷酸时,常常得出似是而非的结果,不仅大大增加了后续实验的工作量,还可能一无所获。怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性 寡核 ...

小弟我这段时间因为实验需要,开始大量的提取脑组织的RNA.以前提取RNA都是做逆转录吊基因用,所以对于RNA的要求不算是特别严格.但是这次的实验要求RNA提取纯度和精度都比较高,所以对于RNA提取的结果也就比较关注.在前一段时间我提取RNA中一个比较明显的问题是在28s的上面会多出一条带,当时在本版上面问了很多战友,也看了相关的贴,发现这是一个比较普遍的问题,对于这条带的解释有些战友说是基因组残余,有些战友 ...

RNA提取和RT-PCR在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼 ...

这段时间做斑点杂交,因为每次做都拿着英文的翻实在太麻烦,也容易出错.为了实验方便将DIG标记检测试剂盒的说明书翻译了一份,与大家共享,如有错误,敬请指正!DNA-DIG标记：1、每个标记反应中加入10ng-3ug DNA，另加ddH2O补充至15ul体积。（未标记的对照DNA加5ul，10ul ddH2O）2、将装有反应物的离心管放入沸水中变性10min，然后迅速冷却；3、然后依次加入以下溶液：Hexanucleotide Mix, ...

重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。美国GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出3类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：Hi ...

这是在网上看到的，觉得还行，大家看一下1、载体和插入片段DNA的量都要比黏末端连接时的用量多，可以增加到5倍以上。2、载体务必去磷酸化处理(许多公司都有这类酶，比如NEB的CIP(点击进入产品页面)。3、如果是PCR生成插入片段，要用产生平端片段的PCR酶(如PFU)，必须磷酸化5'末端，可以磷酸化引物，也可以磷酸化产物，我一般磷酸化产物，这一步最关键也最容易遗漏(请参考T4PNK(点击进入产品介绍)。普通Taq酶PCR ...

随着人类基因组计划的顺利进行,越来越多的新基因被发现,基因功能研究成为生命科学领域中的重大课题,目前基因功能研究方法主要有基因转导、反义技术、转基因和基因剔除、染色体转导、RNA 干涉等。一、正常情况：DNA→mRNA→蛋白质→功能（遗传效应以及表型）二、基因功能研究策略：1、基因功能的获得（gain-of-function）如：GFP转基因鼠1）、基因转移（transgenic）：(1)、 指外源基因导入受体细胞后能随即整合到受体的 ...

使用Clontech公司的In-Fusion PCR Cloning Kit快两年了，在此谈谈心得。早期的In-Fusion PCR Cloning Kit是干粉，现在已经发展成为试剂盒，两种我都用过。相关原理和具体操作步骤可以下载公司网站的说明书http://www.clontech.com/images/pt/PT4065-1.pdf。此方法最大的优点就是不用考虑插入片段的正反性，只要链接成功就是阳性克隆。但是有时候链接效率低，比较不容 ...

加分作为鼓励，因为有的问题还需要继续讨论！谢谢！第一次做双酶切连接有90％连接成功率（挑了24个克隆），重复性也不错。兴奋之余，相与丁香园各位战友一起分享经验，因为以前得到了许多帮助。准备：目的片段PCR产物胶回收，用乙醇沉淀法纯化胶回收产物，并经紫外分光光度计计算其浓度（A）质粒同样经乙醇沉淀法纯化，测定纯化产物的浓度（B）酶切：目的片断和质粒分别进行双酶切，大约10单位酶能完全切断1μg左右的DNA片断(A/B) 1 μg酶1 ...

最近利用trisol（Qiagen公司）进行肝脏病理标本RNA抽提，按照试剂的说明书进行操作：取小于50mg的RNAlater（Sigma公司）保存的样本，置于1ml的trisol中匀浆；匀浆结束后室温放置5min左右，加入200ul氯仿，以振荡器剧烈震荡15秒混匀，室温或冰上（此处各家说法不一，我自己测试好像没有发现很大差异）放置5-10min；4度，12000g离心15min，吸取上清至新的1.5ml离心管中；在 ...

MicroRNA Interference TechnologiesBy Zhiguo WangPublisher: SpringerNumber Of Pages: 193Publication Date: 2009-08-01ISBN-10 / ASIN: 3642004881ISBN-13 / EAN: 9783642004889Description:MicroRNAs (miRNAs), endogenous noncoding regulatory mRNAs of around 22-nu ...