【申请加分】双酶切连接简便高效方法

加分作为鼓励，因为有的问题还需要继续讨论！谢谢！

第一次做双酶切连接有90％连接成功率（挑了24个克隆），重复性也不错。兴奋之余，相与丁香园各位战友一起分享经验，因为以前得到了许多帮助。

准备：目的片段PCR产物胶回收，用乙醇沉淀法纯化胶回收产物，

并经紫外分光光度计计算其浓度（A）

质粒同样经乙醇沉淀法纯化，测定纯化产物的浓度（B）

酶切：目的片断和质粒分别进行双酶切，大约10单位酶能完全切断1μg

左右的DNA片断

(A/B) 1 μg

酶1 0.5 μL

酶2 0.5 μL

1undefined通用buffer 2 μL

加ddH2O 补足到20 μL

37℃酶切1.50h,尽量使其酶切完全。

限制性内切酶的灭活：将酶切反应管直接放入 65℃水浴，15min无需进行胶回收，将酶灭活后的酶切反应物直接用于连接反应，但是有一点非常重要，就是计算好插入量和载体的连接摩尔比，因为没有进行胶回收纯化，会有一些小片段干扰连接反应，如载体自连等，目的片段的摩尔数大于载体的3～6倍，会大大减少这些干扰的出现，实践证明这是非常重要的。

连接：连接反应前将目的片段的酶切反应液a和载体片断的酶切反应液b放入50℃水浴中5min，减少自连产生。根据连接反应摩尔比，计算加入的a和b的量分别为:a1和b1,在加入1μLT4ligasa 和1μLbuffer,加水补足到10μL。混匀后，4℃放过夜。希望各位看后能指出其中的不足，也能有所收获。

斑竹能否鼓励一下？