【共享】DIG标记检测试剂盒中文说明书
丁香园论坛
1991
这段时间做斑点杂交,因为每次做都拿着英文的翻实在太麻烦,也容易出错.为了实验方便将DIG标记检测试剂盒的说明书翻译了一份,与大家共享,如有错误,敬请指正!
DNA-DIG标记：
1、 每个标记反应中加入10ng-3ug DNA，另加ddH2O补充至15ul体积。（未标记的对照DNA加5ul，10ul ddH2O）
2、 将装有反应物的离心管放入沸水中变性10min，然后迅速冷却；
3、 然后依次加入以下溶液：
Hexanucleotide Mix, 10× 2ul
dNTP Labeling Mix 2ul
Klenow enzyme labeling grade 1ul
轻微离心，37℃过夜。
4、 加入2ul EDTA(0.2M Ph8.0)终止反应。（或65℃，10min）
标记效率检测：
标记好的探针和对照稀释到1ng/ul。然后依次稀释为10pg/ul、3pg/ul、1pg/ul、0.3pg/ul、0.1pg/ul、0.03pg/ul、0.01pg/ul，检测各浓度的显色情况。
1、 分别取1ul各种浓度的探针点到一小块尼龙膜上；
2、 紫外交联固定（或120℃ 30min烘烤固定）
3、 将膜放在一个装有20ml Maleic acid buffer的塑料容器中，15℃-25℃摇2min；
4、 10ml Blocking solution温浴30min；
5、 10ml Antibody solution温浴30min；
6、 10ml Washing buffer洗15min，换buffer后再洗15min；
7、 在10ml Detection buffer中平衡2-5min；
8、 黑暗条件下，将膜于2ml新鲜的colorsubstrate solution中显色（显色时不能摇动）
9、 待显色完全后TE-buffer或ddH2O中洗5min终止反应。
杂交：
1、 将适量体积（20ml/100cm2）的DIG Easy Hyb中预热到杂交温度，轻微摇动预杂交30min；
2、 DIG-labeled 探针（约25ng/ml）于沸水中煮5min变性，迅速冰浴；
3、 变性的DIG-labeled探针加入适量（3.5ml/100cm2）预热的DIG Easy Hyb中，混合，避免气泡产生；
4、 倒掉预杂交液，加入探针和预热的DIG Easy Hyb的混合液于膜上，杂交过夜。
严谨洗涤：
1、 杂交膜用2×SSC，0.1%SDS于15℃-25℃洗涤2次，每次5min；
2、 再用0.5×SSC，0.1%SDS（预热到洗涤温度）65-68℃洗涤2次，每次15min。
免疫检测：
1、 杂交和严谨洗涤后的膜用Washing buffer中冲洗1-5min；
2、 100ml Blocking solution温浴30min；
3、 20ml Antibody solution温浴30min；
4、 100ml Washing buffer洗涤2次，每次15min；20ml Detection buffer中平衡2-5min；
5、 黑暗条件下，将膜于10ml新鲜的colorsubstrate solution中显色（显色时不能摇动）；
6、 待显色完全后50ml TE-buffer或ddH2O中洗5min终止反应。
DNA-DIG标记：
1、 每个标记反应中加入10ng-3ug DNA，另加ddH2O补充至15ul体积。（未标记的对照DNA加5ul，10ul ddH2O）
2、 将装有反应物的离心管放入沸水中变性10min，然后迅速冷却；
3、 然后依次加入以下溶液：
Hexanucleotide Mix, 10× 2ul
dNTP Labeling Mix 2ul
Klenow enzyme labeling grade 1ul
轻微离心，37℃过夜。
4、 加入2ul EDTA(0.2M Ph8.0)终止反应。（或65℃，10min）
标记效率检测：
标记好的探针和对照稀释到1ng/ul。然后依次稀释为10pg/ul、3pg/ul、1pg/ul、0.3pg/ul、0.1pg/ul、0.03pg/ul、0.01pg/ul，检测各浓度的显色情况。
1、 分别取1ul各种浓度的探针点到一小块尼龙膜上；
2、 紫外交联固定（或120℃ 30min烘烤固定）
3、 将膜放在一个装有20ml Maleic acid buffer的塑料容器中，15℃-25℃摇2min；
4、 10ml Blocking solution温浴30min；
5、 10ml Antibody solution温浴30min；
6、 10ml Washing buffer洗15min，换buffer后再洗15min；
7、 在10ml Detection buffer中平衡2-5min；
8、 黑暗条件下，将膜于2ml新鲜的colorsubstrate solution中显色（显色时不能摇动）
9、 待显色完全后TE-buffer或ddH2O中洗5min终止反应。
杂交：
1、 将适量体积（20ml/100cm2）的DIG Easy Hyb中预热到杂交温度，轻微摇动预杂交30min；
2、 DIG-labeled 探针（约25ng/ml）于沸水中煮5min变性，迅速冰浴；
3、 变性的DIG-labeled探针加入适量（3.5ml/100cm2）预热的DIG Easy Hyb中，混合，避免气泡产生；
4、 倒掉预杂交液，加入探针和预热的DIG Easy Hyb的混合液于膜上，杂交过夜。
严谨洗涤：
1、 杂交膜用2×SSC，0.1%SDS于15℃-25℃洗涤2次，每次5min；
2、 再用0.5×SSC，0.1%SDS（预热到洗涤温度）65-68℃洗涤2次，每次15min。
免疫检测：
1、 杂交和严谨洗涤后的膜用Washing buffer中冲洗1-5min；
2、 100ml Blocking solution温浴30min；
3、 20ml Antibody solution温浴30min；
4、 100ml Washing buffer洗涤2次，每次15min；20ml Detection buffer中平衡2-5min；
5、 黑暗条件下，将膜于10ml新鲜的colorsubstrate solution中显色（显色时不能摇动）；
6、 待显色完全后50ml TE-buffer或ddH2O中洗5min终止反应。
