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        【共享】酶切常见问题与原因及解决办法!

        丁香园论坛

        17554
        问题:
        原因
        解决办法

        DNA完全没有被内切酶切割:
        1) 内切酶失活
        标准底物检测酶活性

        2) DNA不纯,含有SDS,酚,EDTA等内切酶抑制因子
        将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA

        3) 条件不适(试剂、温度)
        检查反应系统是否最佳

        4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化
        换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株

        5) DNA酶切位点上没有甲基化(如Dpn I)
        换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA(如San3A I代替Dpn I),重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增

        6) DNA位点上存在其它修饰
        将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证

        7) DNA不存在该酶识别顺序
        换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证

        DNA切割不完全:
        1) 内切酶活性下降
        用5-10倍量过量消化

        2) 内切酶稀释不正确
        用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶

        3) DNA不纯,反应条件不佳
        同上

        4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰
        同上

        5) 部分DNA溶液粘在管壁上
        反应前离心数秒

        6) 内切酶溶液粘度大,取样不准
        将内切酶稀释,增大取样体积

        7) 酶切后DNA粘末端退火
        电泳前将样品置65℃保温5-10分钟,取出后置冰浴骤冷

        8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
        使用标准反应缓冲液及温度,避免强烈振荡

        9) 过度稀释使酶活性降低
        适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏

        10)反应条件不适
        使用最佳反应体系

        11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
        加大酶量5-10倍

        DNA片段数目多于理伦值:
        1) 内切酶星状活性
        检查反应条件:甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2+的存在及酶:DNA值过大均均可导致星状活性,降低酶的用量

        2) 其它内切酶污染
        用λDNA作底物检查酶切结果

        3) 底物中含其它DNA杂质
        电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA片段

        酶切后没有观察到DNA片段的存在:
        1) DNA定量错误(如RNA含量较高)
        用RNA酶A(无DNA酶)100ug/ml消化DNA样,酚抽提后沉淀溶解,定量

        2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀
        在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次

        内切酶保存期内快速失活:
        1) 保存温度不合适
        内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存

        2) 以稀释形式保存
        稀释酶液不宜长期存放,应一次使用

        3) 贮藏缓冲液不适当
        使用厂家推荐的贮藏缓冲液

        4) 低蛋白浓度
        内切酶与500ug/ml的BSA一起保存

        电泳后DNA片段的带型弥散,不均一:
        1) DNA上结合有蛋白质
        电泳前上样液65℃加热5min,并加入0.1%的SDS,酚/氯仿抽提纯化

        2) 内切酶中含有DNA外切酶
        减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶

        酶切后的DNA片段连接效率低:
        1) 含磷酸盐的浓度高
        透析,乙醇沉淀去除磷酸盐

        2) 内切酶失活不全或含有ATP酶
        延长灭活时间或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA

        3) 平末端连接
        加大T4 DNA Ligase用量

        4) 外切酶污染
        减少酶用量,缩短保温时间,酚抽提回收DNA

        5) 连接缓冲液不合适
        重新配制连接缓冲液
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