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结构分子生物学进展梁栋材随着学科的交叉渗透和科学技术的迅速发展，一个极其重要的分支学科——结构分子生物学正在高速发展，并已成为当前分子生物学中的一个重要前沿学科。结构分子生物学是结构生物学中最活跃的研究层次，它是在分子层次上从结构角度特别是从三维结构的角度研究和阐明当前生物学中各个前沿领域的重要学科问题。结构分子生物学是一个包括生物学、物理学、化学和计算数学等多学科交叉的，以结构（特别是三维结构）测定为手段， ...

各位园友大家好，我想从蛋鸡的腹脂中提取RNA，进行RT-PCR,以beta-actin为内参，测定蛋鸡腹脂中激素敏感脂肪酶（HSL）和脂蛋白脂酶（LPL)mRNA的丰度.现需要设计几对引物。扩增激素敏感脂肪酶（HSL)基因的引物，扩增脂蛋白脂酶(LPL)基因的引物以及内参beta-actin的引物。beta-actin分别在这两种酶表达中作为内参时它的引物是否也不一样，会因酶而异。我从NCBI上查到这两种酶以及内参在禽 ...

一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有 ...

引物设计对于在做PCR实验的同志们来说是必不可少一项。本人从开始做PCR由不会设计引物到会，其中感概颇多。这里就PCR引物设计的几个基本法则谈谈，和大家分享一下。引物设计的基本法则1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物 ...

大家好，Fluidigm BioMark 系统通过集成流体通路（Integrated Fluidic Circuit, IFC），将上万个微小管道、控制阀门集成到微板上，形成纳升（nL）量级的反应仓，不需特别移液器，就可以同时进行多达近万个常规qPCR (传统Taqman 或其他) 实验。操作简单，既有传统qPCR可定量之好处，又有基因芯片高通量耗材少之优点，能大幅提高实验效率及准确度。· 单个细胞基因表达( Single Cell Gene Expression): ...

PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA ...

PCR引物设计及软件1. 引物设计的原则引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal s ...

PCR 引物设计及软件使用技巧张新宇，朱有康，高燕宁（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编 ...

PCR常见问题总汇来源：友谊中联生物科技PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多 ...

PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA ...

PCR方法实验步骤和常见问题王秀英 (mary at labome dot com)美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)译者王秀英 (mary at labome dot com)美国新泽西州普林斯顿合原研究有限责任公司 (Synatom Research)DOIhttp://dx.doi.org/10.13070/mm.cn.1.187日期更新 : 2014-11-05; 原始版 : 2011-10-18引用实验材料和方法 2011;1:187英文摘要A t ...

--------------------------------------------------------------------------------虽然长了些, 但耐心看完,应该对你的问题有所帮助各位战友 我们来聊聊PCR ：）PCR可以说是目前分子生物学实验中应用最为广泛的一种技术。从最初的在几个水浴锅里把试管放来放去，到现在各种先进的PCR仪， 到REAL TIME PCR。 设备是越来越先进，方法是越来越多，但基本的原理还是那套。然而实际操作中，仍然有很多的问题让人头疼。正好看到有人建议来个PC ...

引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性：在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非...关键词：要点注意设计结构模板延伸引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个 ...

引言　　聚合酶链反应PCR使不同来源的特异核酸片段的分离及分析发生了革命，但应用PCR分 离，分析特定DNA区域需要了解靶区域的边侧序列，这使扩增局限于已知DNA序列。我 们研究了从复杂的人和其他种DNA混合物中扩增未知DNA序列。特别是，我们应用PCR 分离出了在啮齿类细胞背景中含有人染色体片段的体细胞杂合体中的人DNA。使存留 在杂合子中的人特异区域序列得到分离和鉴定，避免了克隆DNA库和用人特异重复序 列探针他离人序列克隆。 ...

一、RT-PCR1. cDNA产量的很低可能的原因：RNA模板质量低对mRNA浓度估计过高反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足同位素磷32过期反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系与反应起始时RNA的总量及纯度有关建议在试验中加入对照RNundefined第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体 ...

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚 ...

PCR技术简史　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想："经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因"。　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在 ...

miRNA实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR从1996年美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种：（1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解 ...

实时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。一. 实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 ...

我搜集了几个植物RT-PCR的内标,与各位共享1． 物种：拟南芥（arabidopsis）或maize2． 基因名称：18S rRNA3． 模板：cDNA4． PCR类型及目的：RT-PCR5． Forward primer (5’-3’): CCATAAACGATGCCGGAReverse primer (5’-3’): CACCACCCATAGAATCAAGAProbe: 无6． 产物长度（bp）：3507． 引物浓度：50 pmol/ul8． 退火温度：54.19． 所用仪器：PE-960010． 提交 ...