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        原位末端标记技术检测细胞凋亡

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        一、DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移(ISNT)
        1.切片常规脱蜡,梯度乙醇复水化。
        2.将切片组织浸入2×SSC液中,80℃,20min,然后蒸馏水冲尽。
        3.0.5%胃蛋白酶(pH2.0)37℃消化0~20min,PBS洗尽。
        4.用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A,5min。缓冲液A:50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2, 10mmol/L β-巯基乙醇,0.005%BSA,pH7.5。
        5.弃去缓冲液A,滴加标记液约50μl,25℃温育1h。标记反应液:0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow大片段。
        6.PBS漂洗2次,各3min。
        7.内源酶阻断剂阻断15min。
        8.PBS洗2次,各3min。
        9.滴加HRP-avidin覆盖组织,室温下30min。
        10.PBS洗2次,各3min。
        11.DAB-H2O2显色约5min。
        12.流水冲洗后,苏木素复染1min。常规脱水,透明,封片。
        13.阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液,余同。

        二、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)
        1.切片常规脱蜡,复水,后续过程在湿盒内进行。
        2.3%的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。
        3.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
        4.切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
        5.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
        6.蛋白酶K或胃蛋白酶消化0~20min。
        7.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
        8.TdT缓冲液孵育10min。
        9.TdT反应液37℃孵育1h。
        10. 切片浸泡在2×SSC溶液10min,以终止反应。
        11. 0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
        12. 链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。
        13. 0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
        14. 0.04%的DAB显色5~10min,镜下控制时间。
        15. 苏木素复染3~5min,常规复水,透明和封片。

         

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